Para começar, incube um tubo contendo tecido hipocampal de camundongo dissociado em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos. Transfira a suspensão de células turvas para um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros da solução de mistura de lavagem.
Em seguida, passe a amostra por um filtro de 70 micrômetros em um tubo de microcentrífuga de cinco mililitros antes de centrifugar novamente. Submeta a amostra à centrifugação com gradiente de Percoll, depois ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de tampão de coloração MACS e incuba. Agora, pipete um mililitro de tampão MACS para a amostra antes de centrifugar.
Em seguida, suspenda o pellet celular em 500 microlitros de tampão MACS. Em seguida, enxágue as colunas de seleção positiva de um separador magnético com três mililitros de tampão MACS. Aplique suavemente 500 microlitros da suspensão celular em uma coluna.
Depois de lavar as colunas três vezes com tampão MACS, coloque as colunas em tubos cônicos de 15 mililitros. Adicione cinco mililitros de buffer MACS na coluna. Em seguida, centrifugue as amostras a 300g por 10 minutos e, em seguida, adicione um mililitro de DMEM pré-aquecido ao pellet.
Transfira 500 microlitros da suspensão celular final para os poços de uma placa de 24 poços. Substitua 250 microlitros de cada poço por DMEM fresco pré-aquecido. Em seguida, adicione três microgramas de sinaptossomos marcados com pHrodo Red sobre a mídia.
Adicione o mesmo volume de sinaptossomos não rotulados aos controles negativos. Após a incubação, lave os poços com DPBS frio. Agora, pipete 200 microlitros de tripsina-EDTA em cada poço.
Após uma incubação de 35 segundos, pipetar um mililitro de DPBS contendo FBS em cada poço. Transfira a suspensão celular para um tubo de polipropileno de cinco mililitros através de uma peneira e, em seguida, lave cada poço duas vezes com 500 microlitros de DPBS gelado. A centrífuga coletou amostras a 500g por cinco minutos.
Em seguida, incube as células em 100 microlitros da solução de coloração por 10 minutos no gelo. Em seguida, adicione CD11b e CD45 à solução de coloração para fazer uma concentração final de 1 a 100. Incubar as amostras a quatro graus Celsius por 20 minutos no escuro.
Pipetar um mililitro de tampão FACS para a amostra e, em seguida, submetê-la a uma centrifugação final a 300 g durante 10 minutos antes da análise por citometria de fluxo. Uma fluorescência de PE positiva comparável à obtida de sinaptossomos em pH 4 foi observada em microglia CD11b positiva e CD45 positiva.
