Para começar, limpe completamente todas as áreas da incubadora e da bomba peristáltica com desinfetante para garantir um ambiente quase estéril. Em seguida, lave cada tubo com 700 microlitros de PBS com magnésio e cálcio, seguidos por 500 microlitros de C2 ou meio condicionado EC. Use a tubulação com a curta distância da trava da isca até a rolha da bomba peristáltica para a cavidade esquerda e a tubulação com a outra simetria para a cavidade direita.
Após recuperar o biochip com células HUVEC e C2BBe1 da incubadora, realizar uma troca de meio com 350 microlitros para cada câmara. Em seguida, mova os plugues do local inferior para o superior. Adicione 350 microlitros do meio fresco à câmara inferior do biochip.
Depois disso, remova todos os plugues e preencha todas as portas até o topo. Começando na cavidade esquerda, insira o adaptador de trava de isca na porta do biochip para conectar o primeiro tubo à porta direita da câmara superior. Em seguida, conecte a segunda tubulação à porta esquerda da câmara inferior.
Em seguida, pegue um reservatório e adicione uma pequena gota de meio de cultura de células no fundo do reservatório. Em seguida, insira o reservatório no lado oposto do primeiro tubo e repita para a outra câmara. Depois que todas as portas estiverem conectadas a uma tubulação ou reservatório, encha os reservatórios com 3,5 mililitros de meio de cultura de células.
Em seguida, coloque o lado solto da tubulação, que tem a tampa presa a ela, no topo do reservatório para fechar o sistema microfluídico de cada câmara. Transporte o biochip para a bomba peristáltica. Usando as rolhas da bomba peristáltica, conecte cada tubulação à bomba peristáltica para que o meio flua do reservatório para a cavidade e volte pela bomba.
Em seguida, perfunda cada câmara com uma vazão de 50 microlitros por minuto. Quando a pré-profusão estiver completa, pare a bomba peristáltica. Remova a tampa conectada ao tubo de cada reservatório e coloque-a sobre um tecido estéril próximo à bomba.
Depois de remover todo o meio, encha os reservatórios com 2 mililitros de meio recém-preparado. Reconecte a tubulação e a tampa e continue a perfusão circular a uma vazão de 50 microlitros por minuto por mais 24 horas. Assim que a bomba peristáltica estiver parada, abra os reservatórios de todas as cavidades.
Esvazie os reservatórios e desconecte a tubulação e os reservatórios do biochip. Lave as cavidades microfluídicas com 500 microlitros de PBS frio com magnésio e cálcio duas vezes por câmara. Adicione 500 microlitros de metanol gelado a todas as cavidades.
Depois de abrir o chip, corte ou remova a folha de ligação do biochip. Corte o tecido contendo membrana PET ao meio para corar em paralelo com diferentes painéis imunológicos. Usando uma pinça de precisão, transfira cada peça de membrana para um poço separado em uma placa de 24 poços com uma solução de bloqueio e permeabilização.
Em seguida, transfira as peças da membrana para uma lâmina de vidro limpa dentro de uma câmara úmida. Adicione 50 microlitros de anticorpo primário preparado e solução de coloração a cada peça de membrana. Uma vez que as amostras são transferidas para uma placa de 24 poços, lave as membranas duas vezes por 5 minutos com solução de lavagem e, em seguida, com PBS contendo magnésio e cálcio.
Usando um meio de montagem de fluorescência e uma lamínula, monte as peças da membrana em uma lâmina de vidro limpa e armazene-as a 4 graus Celsius até a imagem microscópica. Após cinco dias de profusão, o DNA nuclear corado com DAPI mostrou macrófagos derivados de monócitos totalmente diferenciados expressando CD68 espalhando-se por todo o tecido vascular. Os HUVECs criaram uma camada confluente mostrando a integridade do tecido pela formação de junções de aderência, como a VE-caderina.
Além disso, o fator de von Willebrand é altamente expresso por HUVECs. Após cinco dias de profusão, as células C2BBe1 formaram camadas de células epiteliais polarizadas expressando as proteínas de junção E-caderina e ZO-1. O crescimento tridimensional de estruturas semelhantes a vilosidades e criptas do epitélio pode ser detectado nas seções x e y da pilha Z após seis dias de perfusão.
