Para começar a ressuspender os macrófagos derivados da medula óssea neonatal do camundongo em DMEM completo sem vermelho de fenol ou antibióticos. Semeie 500 microlitros de suspensão celular a uma densidade de 200.000 por quadrante em uma placa quádrupla de 35 milímetros. Remova o estoque pré-calculado de Escherichia coli de menos 80 graus Celsius.
Alíquota do volume desejado de suspensão celular em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro para preparar o inóculo bacteriano em uma multiplicidade de infecção de 25 e, em seguida, adicione PBS a um volume total de um mililitro. Centrifugue a suspensão bacteriana a 2000 G por cinco minutos e ressuspenda o pellet em 50 microlitros de PBS. Adicione corante verde fluorescente sensível ao pH a uma concentração final de 500 micro molares e incube por 20 minutos no escuro para conjugação do corante.
Lavar as bactérias quatro vezes com um mililitro de PBS por centrifugação a 1000 G durante cinco minutos. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de DMEM completo sem vermelho de fenol e adicione as culturas de macrófagos derivados da medula óssea. Incube a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas.
Adicione 200 nanogramas de corante fluorescente vermelho permeável a células para corar os lisossomos, Após a infecção bacteriana, foram detectadas abundantes bactérias fluorescentes verdes fagocitadas dentro de macrófagos derivados da medula óssea. A fluorescência verde localiza-se ainda mais com fluorescência vermelha indicativa de lisossomos acidificados. A fagocitose e o aparecimento de macrófagos derivados da medula óssea neonatal dipositivos sensíveis ao pH verde também foram observados durante a infecção de quatro horas.
