Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health [R01 AI163333] à CMR. Nous tenons à souligner le soutien financier supplémentaire apporté à la plateforme de cytométrie en flux et de cellule unique de l’Université de Virginie-Occidentale par les subventions suivantes : GM104942 de subvention CTSI de WV, GM121322 de subvention CoBRE de microenvironnement tumoral et OD016165 de subvention NIH.

Toutes les procédures ont été approuvées par les comités institutionnels de protection et d’utilisation des animaux de Virginie-Occidentale et ont été effectuées conformément aux recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches. Des bébés souris C57BL/6J ont été utilisés pour cette étude. Les détails de tous les réactifs et équipements utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Préparation des supports
<ol><li>Dans un tube à centrifuger de 5 ml, préparez 3 ml de milieu de culture MEM complété par 10 % de FBS, 2 mM de glutamine, 25 mM de HEPES et de pénicilline (100 μg/mL)/streptomycine (100 μg/mL) et conservez-le sur de la glace.</li>
	<li>Si nécessaire pour stocker les progéniteurs de la moelle osseuse dans de l’azote liquide, préparez un milieu de congélation contenant 10 % de DMEM, 80 % de FBS et 10 % de DMSO.</li>
	<li>Pour un DMEM complet, préparez du DMEM complété par 10 % de FBS, 2 mM de glutamine, 25 mM d’HEPES et de la pénicilline (100 U/mL)/streptomycine (100 μg/mL).</li>
	<li>Pour la différenciation des macrophages, préparer du DMEM complété par 10 % de FBS, 2 mM de glutamine, de la pénicilline (100 U/mL)/streptomycine (100 μg/mL) et 10 % de surnageant à cellules L929 9,10,11.</li>
</ol>2. Préparation du surnageant à cellules L929
<ol><li>Décongelez les cellules L929 stockées dans de l’azote liquide et transférez-les dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 5 mL de DMEM complet. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu DMEM complet et les ensemencer dans un flacon de culture tissulaire T25 à la densité de 2×105 cellules. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé avec 0,4 % de bleu trypan. Incuber à 37 °C avec 5% de CO2 jusqu’à ce qu’ils atteignent 70% de confluence.</li>
	<li>Pour détacher les cellules, lavez-les d’abord avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Aspirez le PBS et remplacez-le par 2,5 mL de trypsine-EDTA à 0,05 %.</li>
	<li>Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 5 min et ajouter 5 mL de DMEM complet.</li>
	<li>Recueillir les cellules et centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension dans 15 mL de milieu DMEM complet et la transférer dans une fiole T75.</li>
	<li>Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu’à ce que les cellules atteignent 90 % de confluence, puis prélever le milieu et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Filtrer le média contenant du M-CSF à travers un filtre de 0,45 μm et congeler à -80 °C dans des aliquotes de 5 mL.</li>
</ol>3. Préparation des animaux
<ol><li>Sous une armoire de biosécurité, séparez soigneusement les bébés souris C57BL/6J âgés de 7 à 9 jours (une portée de 6 petits) de la mère et placez-les dans une cage séparée.</li>
	<li>Faites tremper une boule de coton dans 2 ml d’isoflurane de qualité vétérinaire dans un bocal ou une autre chambre de confinement.</li>
	<li>Placez un chiot dans la chambre et fermez le couvercle. Surveillez le nouveau-né pendant environ 90 secondes pour vous assurer qu’il devient immobile et inconscient.</li>
	<li>Retirez rapidement le chiot et décapitez-le avec des ciseaux bien aiguisés (en suivant les protocoles approuvés par l’institution) avant que le chiot ne puisse reprendre conscience. REMARQUE : Les nouveau-nés ne respirent pas assez profondément pour être euthanasiés par inhalation d’isoflurane seule.</li>
	<li>Assurez-vous de fermer le couvercle du récipient après avoir retiré chaque chiot. La même boule de coton peut être utilisée pour 5 à 7 chiots.</li>
</ol>4. Isolement de la moelle osseuse néonatale
<ol><li>Stérilisez le corps du nouveau-né avec de l’éthanol à 70%.</li>
	<li>"À l’aide de pinces et de ciseaux chirurgicaux à pointe fine, faites une incision entre les abdomen et pattes arrière. Retirez la peau en tirant vers le pied des membres postérieurs.</li>
	<li>Grattez le tissu conjonctif et le muscle attaché aux os à l’aide d’une pince à arêtes vives.</li>
	<li>Coupez le tibia et le fémur, comme le montre la figure 1, avec des ciseaux pour les détacher et les retirer. À l’aide d’une pince, placez ces os dans le tube de média sur de la glace. Répétez le processus pour chaque chiot.</li>
	<li>Transférez les os à l’aide d’une pince dans une passoire de 40 μm avec un tube de prélèvement. Écrasez les os et libérez la moelle en appuyant avec un piston de seringue de 3 ml contre la passoire.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 350 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension par pipetage doux dans du NaCl à 0,2 %, une solution hypotonique pour la lyse des érythrocytes. Ajouter immédiatement un volume égal de 1,6% de NaCl pour amener la solution à isotonique.</li>
	<li>Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et prélever la solution de lyse.</li>
	<li>Remettre en suspension dans un DMEM complet pour une utilisation immédiate ou dans un milieu de congélation pour le stockage et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. REMARQUE : Pour la présente étude, cette méthode a donné 6,55 (± 1,44) ×10 6 cellules de moelle osseuse par petit (figure 1E).</li>
	<li>Stockez les cellules à -80 °C dans un fluide de congélation ou utilisez-les immédiatement comme décrit ci-dessous. REMARQUE : En raison de l’âge, les os sont suffisamment transparents et clairs pour visualiser la moelle à travers eux. Il est important d’être prudent lorsque vous tirez sur les os, car l’application d’une légère pression sur ceux-ci peut suffire à libérer la moelle. La moelle osseuse du nouveau-né se présente sous la forme d’un liquide plutôt que d’un fil intact que l’on trouve dans les os adultes. Il est difficile de prélever la moelle si elle s’échappe lors du prélèvement des os.</li>
</ol>5. Différenciation des macrophages dérivés de la moelle osseuse néonatale
<ol><li>Ensemencer 2 × 107 cellules de moelle osseuse par fiole T75 dans 10 mL de DMEM complet contenant 10 % de surnageant de cellules L929 (2,5 mL) comme source de M-CSF. Incuber les boîtes de culture à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 5 jours. Ajouter 2 mL de milieu conditionné au L929 au jour 3 de la différenciation.</li>
	<li>Observez quotidiennement les cellules au microscope à l’aide d’un microscope inversé et d’un système d’imagerie avec un grossissement de 20x. Lors de la différenciation, les macrophages doivent apparaître adhérents, allongés et hétérogènes (Figure 2).</li>
	<li>Pour récolter les macrophages pour les tests en aval, aspirez le milieu de différenciation.</li>
	<li>Lavez les cellules avec 5 ml de PBS pour éliminer les cellules non adhérentes et les protéines sériques qui interféreront avec le détachement. Aspirer le PBS.</li>
	<li>Récoltez les cellules en ajoutant 5 ml de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le ballon. Placer le ballon de culture à 37 °C avec un incubateur à 5 % de CO2 pendant 5 min et ajouter 5 mL de DMEM.</li>
	<li>Pipeter les cellules à détacher et centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Dissociez la pastille cellulaire dans 1 mL de DMEM complet, puis comptez et vérifiez la viabilité cellulaire à l’aide de bleu trypan. Les DMBO isolées à l’aide de cette méthode sont de 7,05 (± 2,52) ×105 cellules/petit (figure 1E). REMARQUE : Observez la présence de cellules fusiformes qui commencent à apparaître au deuxième jour de la différenciation (Figure 1B, flèches rouges). Si la couleur du support devient jaune, indiquant qu’il est épuisé, ajoutez plus de support conditionné L929 au jour 4 de la différenciation ; Le remplacement complet du support n’est pas recommandé.</li>
</ol>6. Immunomarquage et analyse cytométrique en flux
<ol><li>Bloquer le marquage par anticorps non spécifiques des BMDM (2x105/marquage) en traitant avec 10 μL/107 cellules de réactif bloquant FcR selon les recommandations du fabricant dans un volume de 100 μL/tampon de cytométrie en flux (PBS complété par 2 mM d’EDTA et 0,5 % d’albumine sérique bovine). Garder sur la glace pendant 10 min. REMARQUE : Les cellules peuvent être bloquées en vrac ou dans des puits ou des tubes individuels. Toutes les étapes suivantes indiquent les quantités et les volumes par étiquette de marqueur cellulaire individuel à un volume final de 100 μL.</li>
	<li>Laver les cellules en ajoutant 200 μL de tampon de cytométrie en flux et centrifuger à 525 x g pendant 7 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez le surnageant et ensemencez les cellules dans une plaque de 96 puits à fond en U à une densité de 5 × 105 cellules par puits. Colorer les cellules en ajoutant le colorant FVS780-Live/Dead cell counting dilué à 3 000 fois et 0,625 μL de BV786-CD11b, PE-F4/80 et AlexaFluor488-CD206 dans 100 μL de tampon de cytométrie en flux, individuellement ou en combinaison 12,13,14,15. Incuber les cellules pendant 45 min sur de la glace recouverte de papier d’aluminium.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de tampon de cytométrie en flux et laver les cellules par centrifugation à 525 x g pendant 7 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirez le surnageant et vortex doucement la pastille cellulaire. Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde à 0,4 % dans chaque puits et incuber toute la nuit à 4 °C.</li>
	<li>Laver les cellules en ajoutant 100 μL de tampon de cytométrie en flux et de pastille par centrifugation à 525 x g pendant 7 min à température ambiante.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon de cytométrie en flux et analyser à l’aide d’un cytomètre en flux.</li>
</ol>7. Essai in vitro pour évaluer l’efficacité phagocytaire des macrophages dérivés de la moelle osseuse néonatale
<ol><li>Remettre les BMDM en suspension dans du DMEM complet sans rouge de phénol ni antibiotiques et les ensemencer à une densité de 2 × 105/quadrant dans une quadruple boîte de 35 mm à un volume de 500 μL.</li>
	<li>Pour préparer l’inoculum bactérien à une multiplicité d’infection (MOI) de 25 ou autre MOI souhaité, prélever un stock précalculé d’Escherichia coli O1 :K1 :H7 stocké à -80 °C.</li>
	<li>Aliquote le volume désiré de bactéries dans un tube de microcentrifugation de 1,7 mL. Lavez les bactéries en ajoutant du PBS à un volume total de 1 ml. Granulez les bactéries par centrifugation à 2 000 x g pendant 5 min à température ambiante. Répétez l’étape de lavage.</li>
	<li>Remettre la pastille bactérienne en suspension dans 50 μL de PBS et ajouter un colorant fluorescent vert sensible au pH jusqu’à une concentration finale de 500 μM. Il s’agit d’un colorant sensible au pH, sans signal fluorescent à pH neutre, qui émet une fluorescence brillante dans les environnements acides, tels que les phagosomes acidifiés, pendant le processus de phagocytose.</li>
	<li>Incuber les cellules bactériennes pendant 20 min dans l’obscurité pour la conjugaison du colorant.</li>
	<li>Laver les bactéries quatre fois avec 1 mL de PBS par centrifugation à 1000 × g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Remettre les bactéries en suspension dans 500 μL de DMEM complet sans rouge de phénol et les ajouter aux cultures BMDM.</li>
	<li>Incuber les BMDM à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 4 h, puis ajouter 200 ng d’un colorant fluorescent rouge perméable aux cellules qui colore les lysosomes. REMARQUE : Les bactéries phagocytaires peuvent être visualisées par microscopie fluorescente.</li>
</ol>

Évaluation par dosage phagocytaire de macrophages dérivés de la moelle osseuse néonatale 

<ol>
	<li>Lucas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+bone+marrow+and+its+role+in+hematopoiesis.">Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).</li><li>Deb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+stem+cells+turn+into+bone+and+fat.">How stem cells turn into bone and fat.</a> N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. 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H., Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+physiological+and+pathological+pregnancy.">Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy.</a> Front Immunol. 10, 792 (2019).</li><li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+CD11c+defines+two+types+of+tissue-resident+macrophages+with+different+origins+in+steady-state+salivary+glands.">Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands.</a> Sci Rep. 12 (1), 931 (2022).</li><li>Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowing+the+immaturity+myth:+The+cost+of+defending+from+neonatal+infectious+disease.">Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease.</a> Front Immunol. 9, 1077 (2018).</li><li>Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+the+newborn+and+young+infant+from+infectious+diseases:+Lessons+from+immune+ontogeny.">Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny.</a> Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).</li><li>Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+characterization+of+murine+young-adult+long+bone+skeletal+progenitors.">Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).</li><li>Winterberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+phenotypic+features+of+neonatal+murine+macrophages).">Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages).</a> Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).</li><li>de Brito Monteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-+and+L929-derived+macrophages+present+distinct+metabolic+profiles+with+similar+inflammatory+outcomes.">M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes.</a> Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts pertinent pour cet article.

La recherche sur des modèles de souris néonatales peut présenter un certain nombre de défis. Les nouveau-nés ont un système immunitaire en développement qui est unique par rapport aux adultes8. En tant que telles, les données générées à partir de modèles animaux adultes ne doivent pas être supposées s’appliquer aux nouveau-nés, et plusieurs travaux publiés ont bien articulé cette idée18,19. Par conséquent, des modèle...

La moelle osseuse renferme des populations de cellules souches hématopoïétiques et mésenchymateuses qui sont auto-renouvelables et peuvent être différenciées en diverses lignées cellulaires. Les cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse donnent naissance aux lignées myéloïdes et lymphoïdes1. Les cellules souches mésenchymateuses produisent des ostéoblastes (os), des adipocytes (graisse) ou des chondrocytes (cartilage)2. Ces cellules ont de multiples applications dans le domaine de la biologie cellulaire et de l’ingénierie tissulaire, y compris la thérapie génique 3,4. Les cellules progénitrices présentes dans la moelle osseuse se différencient en types de cellules spécifiques en présence de facteurs de croissance spécifiques à la lignée. L’érythropoïétine favorise la prolifération des cellules progénitrices érythroïdes, le facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF) stimule la croissance des colonies de neutrophiles et la thrombopoïétine régule la production de plaquettes comme quelques exemples de facteurs de croissance spécifiques à la lignée5. L’antigène de surface cellulaire marqué FACS et le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) sont des méthodes bien établies pour l’isolement et la purification des types cellulaires spécifiques dérivés de la moelle osseuse6.
Bien que les études néonatales progressent vers la découverte des causes des décès néonatals et la résolution des complications lors des naissances prématurées, le développement thérapeutique direct reste un besoin médical non satisfait. Smith et Davis ont déclaré que « les patients pédiatriques restent des orphelins thérapeutiques »7. Il y a plusieurs défis, tels que la petite taille des échantillons, les effets à vie du résultat et les questions éthiques liées à l’obtention du consentement dans les études cliniques sur les nouveau-nés8. Par conséquent, il existe une forte demande de modèles d’étude in vivo et in vitro spécifiques aux nouveau-nés pour atteindre une pertinence translationnelle. En raison des similitudes entre les niveaux anatomiques et tissulaires, des courtes périodes de gestation et de la taille des portées, les rongeurs sont le système modèle de mammifère le plus étudié.
Ici, nous décrivons une procédure détaillée, hautement réalisable et reproductible pour isoler la moelle osseuse de petits souris âgés de 7 à 9 jours et leur capacité à se différencier en macrophages. Cependant, une variété de lignées cellulaires pourrait être obtenue en utilisant des signaux de différenciation distincts. Nous démontrons également la présence de marqueurs de surface cellulaire et la présence d’une activité phagocytaire in vitro attendue pour les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542040</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round (U) bottom plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-65</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b-BV786</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740861</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>141709</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565410</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSI-C3ACC</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>WN182</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli O1:K1:H7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>11775</td>
			<td>Infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-563-649</td>
			<td>Cell Imaging System&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Avantor&#160;</td>
			<td>76419-584</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBright BMDM</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Dye free culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30034.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-929</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Flowcytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysotracker red DND 99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-010-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin /streptomycin&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo green STP ester&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35369</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Cell star</td>
			<td>658170</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300120</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>P20GM103434</td>
			<td>Confocal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal mouse bone marrow isolation and preparation of bone marrow-derived macrophages

Diverses techniques permettant d’isoler la moelle osseuse de souris adultes ont été bien établies. Cependant, l’isolement de la moelle osseuse de souris néonatales est difficile et prend du temps, mais pour certains modèles, cela est pertinent et nécessaire sur le plan translationnel. Ce protocole décrit une méthode efficace et simple pour préparer les cellules de moelle osseuse de chiots âgés de 7 à 9 jours. Ces cellules peuvent ensuite être isolées ou différenciées en types de cellules d’intérêt spécifiques. Les macrophages sont des cellules immunitaires cruciales qui jouent un rôle majeur dans l’inflammation et l’infection. Au cours du développement, les macrophages néonatals contribuent de manière significative au remodelage des tissus. De plus, le phénotype et les fonctions des macrophages néonatals diffèrent de ceux de leurs homologues adultes. Ce protocole décrit également la différenciation des macrophages néonatals à partir des cellules isolées de la moelle osseuse en présence d’un milieu conditionné par L929. Les marqueurs de surface des macrophages néonatals différenciés ont été évalués à l’aide d’une analyse cytométrique en flux. Pour démontrer la fonctionnalité, l’efficacité phagocytaire a également été testée à l’aide d’Escherichia coli conjugué à un colorant sensible au pH.

Bone marrow encloses both hematopoietic and mesenchymal stem cell populations that are self-renewable and can be differentiated into various cell lineages.&#160;Hematopoietic stem cells in the bone marrow give rise to myeloid and lymphoid lineages1. Mesenchymal stem cells produce osteoblasts (bone), adipocytes (fat), or chondrocytes (cartilage)2. These cells have multiple applications in the field of cell biology and tissue engineering, including gene therapy3,4. Progenitor cells present in the bone marrow differentiate into specific cell types in the presence of lineage-specific growth factors. Erythropoietin promotes the proliferation of erythroid progenitor cells, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) stimulates the growth of neutrophil colonies, and thrombopoietin regulates the production of platelets as a few examples of lineage-specific growth factors5. Cell surface antigen labeled FACS and magnetic-activated cell sorting (MACS) are well-established methods for isolation and purification of the specific bone marrow-derived cell types6.
Though neonatal studies are advancing toward finding the causes of neonatal deaths and addressing the complications during premature births, direct therapeutic development remains an unmet medical need. Smith and Davis stated, &#34;Pediatric patients remain therapeutic orphans&#34;7. There are several challenges, such as small samples, lifelong effects of the outcome, and ethical issues in obtaining consent in clinical studies of neonates8. Hence, there is a high demand for in vivo and in vitro study models specific to neonates to achieve translational relevance. Because of the similarities between anatomical and tissue levels, short gestational periods, and litter sizes, rodents are the most studied mammalian model system.
Here, we describe a detailed, highly feasible, and reproducible procedure for isolating bone marrow from 7-9-day-old mouse pups and their ability to differentiate into macrophages. However, a variety of cell lineages could be achieved with the use of distinct differentiation signals. We also demonstrate the presence of cell surface markers and the presence of in vitro phagocytic activity expected for bone marrow-derived macrophages (BMDMs).

Pleins feux sur l’auteur : Mise au point d’une méthode reproductible pour isoler les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris néonatales afin de faire progresser les réponses immunitaires au

Isolement de moelle osseuse de souris néonatale et préparation de macrophages dérivés de la moelle osseuse

En utilisant la méthode décrite dans cette étude, 25 à 37 millions de cellules de moelle osseuse peuvent être isolées avec succès à partir d’une portée de cinq petits souris C57BL/6. Cette méthode a été validée avec des portées de 5 à 7 petits. L’âge minimum pour l’isolement dans nos expériences a été de 7 jours. En fonction de la taille de la portée et du nombre de cellules nécessaires à l’expérience inférieur à un million, les chercheurs pourraient tenter ce protocole pour des souris de...

Ce protocole décrit une méthode non enzymatique et simple pour isoler des cellules de moelle osseuse de souris néonatales âgées de 7 à 9 jours et générer des macrophages différenciés en utilisant un surnageant de cellules L929 comme source de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (M-CSF). Les macrophages dérivés de la moelle osseuse ont été analysés plus en détail pour les antigènes de surface F4/80, CD206, CD11b et la compétence fonctionnelle.

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...

Le but de cette étude est de comprendre certaines des limites de la réponse immunitaire précoce à l’infection bactérienne. Pour ce faire, nous devons développer et utiliser des modèles de recherche spécifiques aux nouveau-nés. L’isolement de la moelle osseuse d’un chiot de sept jours est difficile et n’est pas bien établi.Les macrophages néonatals dérivés de la moelle osseuse sont sensibles et sujets au stress par rapport aux autres DMO. La technique utilisée dans ce protocole est simple et reproductible. Cette méthode guide les utilisateurs dans l’isolement de la moelle osseuse de souris néonatales âgées de sept à neuf jours sans utiliser d’enzymes.Cette étude fournit une stratégie standardisée pour générer des macrophages dérivés de la moelle osseuse à partir de souris néonatales qui peuvent être utilisés pour répondre à des questions sur l’immunologie néonatale. Cette méthode reproductible fournit un modèle spécifique à l’âge pour faire progresser la recherche sur l’immunité néonatale dans de nombreux domaines d’expertise.

neonatal-mouse-bone-marrow-isolation-preparation-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

1.1K vues.  West Virginia University School of Medicine. Le but de cette étude est de comprendre certaines des limites de la réponse immunitaire précoce à l’infection bactérienne. Pour ce faire, nous devons développer et utiliser des modèles de recherche spécifiques aux nouveau-nés. L’isolement de la moelle osseuse d’un chiot de sept jours est difficile et n’est pas bien établi.Les macrophages néonatals dérivés de la moelle osseuse sont sensibles et sujets au stress par rapport aux autres DMO. La technique utilisée dans...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Mise au point d’une méthode reproductible pour isoler les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris néonatales afin de faire progresser les réponses immunitaires au

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.