Depois de expandir os colonoides derivados do paciente com doença de Crohn em uma placa de 48 poços, remova suavemente o meio da borda do poço sem danificar a cúpula do colonoide. Adicione 300 microlitros de reagente de dissociação enzimática suplementado com 10 ROC1 micromolar e dois inibidores Y-27632 a cada poço. Usando uma ponta de pipeta P1000, raspe a superfície do poço para quebrar a cúpula do colonóide e pipetar a suspensão da célula para cima e para baixo.
Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Incube os colonóides coletados em banho-maria a 37 graus Celsius por cinco minutos. Centrifugue os colonóides a 400 x g por três minutos e remova o sobrenadante, deixando aproximadamente 1,2 mililitros no tubo.
Em seguida, coloque a ponta da pipeta P1000 na suspensão, segurando-a logo acima do fundo do tubo e pipete rapidamente a suspensão para dentro e para fora da ponta para dissociar os colonóides. Observe o tubo sob o microscópio para garantir que não haja colonóides inteiros. E os fragmentos de colonóides têm aproximadamente 30 a 40 micrômetros de tamanho.
Em seguida, adicione 10 mililitros de mídia de lavagem organoide gelada ao tubo de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 400 x g durante três minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio de lavagem organoide gelado.
Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e rotule-o como um tubo de fragmento de colonóide. Após a mistura, transfira 50 microlitros da amostra para um novo tubo e rotule-o como um tubo de contagem de células. Centrifugar o tubo a 400 x g durante três minutos.
Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de reagente de dissociação enzimática, suplementado com 10 micromolares Y-27632. Incube o tubo de contagem de células únicas em banho-maria a 37 graus Celsius por cinco minutos. Usando uma pipeta P1000 ajustada para 400 microlitros, pipete rapidamente a amostra.
Em seguida, observe a amostra ao microscópio para garantir uma única suspensão celular. Adicione um mililitro de mídia de lavagem organoide ao tubo de contagem de células únicas. Em seguida, centrifugue a suspensão e remova o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 50 microlitros de meio de lavagem organoide.
Adicione 50 microlitros de azul de tripano e conte as células usando um hemocitômetro. Com base nisso, calcule a concentração de células no tubo do fragmento do colonoide. Centrifugue o volume necessário em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Em seguida, remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet no extrato de membrana basal ou BME. Agora, em uma placa de microtitulação pré-incubada de 96 poços, pipete reversa 10 microlitros da solução de BME do colonóide por poço e misture cuidadosamente a solução regularmente para evitar a semeadura irregular.
Inverta a placa e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 20 minutos, cubra as cúpulas com 200 microlitros de meios de proliferação organoide pré-aquecidos e continue a incubação por três dias.
