Depois de incubar os colonoides derivados de pacientes com doença de Crohn por três dias, incline a placa e remova o meio da borda dos poços. Adicione 200 microlitros por poço de meio de tratamento de citocinas contendo 2,5 corantes de morte celular fluorescente micromolar. Incube os colonóides a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono pelo tempo de tratamento necessário.
Após a incubação, transferir a placa para a fase de um microscópio de epifluorescência digital invertido e confirmar que os colonoides da condição de toxicidade máxima estão totalmente lisados. Usando o canal de transmissão, concentre-se em um colonóide com células positivas para SYTOX. Em seguida, mude para o canal GFP.
Ajuste a intensidade da luz e o tempo de exposição para maximizar o sinal fluorescente enquanto minimiza o fundo. Usando configurações de imagem otimizadas, observe as condições de ausência de corante e toxicidade máxima para garantir que as amostras não estejam superexpostas ou subexpostas. Adquira imagens de transmissão e GFP de colonoides usando uma abordagem de amostragem aleatória, selecionando campos de visão que seguem um padrão de grade fixa cobrindo a cúpula do colonoide.
Salve imagens em formato gráfico de rede portátil e exporte-as. Arraste e solte os arquivos do conjunto de dados de imagem na barra de ferramentas do ImageJ e clique sequencialmente em Imagem, Pilhas e Imagens a serem empilhadas para combinar os arquivos. Em seguida, clique em Imagem seguido de Tipo e 8 bits para converter a pilha de imagens em um arquivo de 8 bits.
Clique na ferramenta Seleções à mão livre e selecione manualmente a região de interesse na imagem de transmissão. Em seguida, alterne entre a pilha de imagens e a imagem do canal GFP correspondente. Na barra de ferramentas, clique em Analisar e definir medidas.
Na janela de diálogo Definir medidas, marque o valor médio de cinza e deixe outras caixas desmarcadas. Com a imagem GFP selecionada, clique em Analisar e medir. Depois que o conjunto de dados for analisado, copie todos os dados na janela de resultados e cole-os em uma planilha.
Calcule a média dos valores médios de cinza da replicação técnica para cada condição. Subtraia a média da condição não tratada de cada condição de tratamento. Em seguida, divida cada condição de tratamento pela média subtraída de fundo da condição de toxicidade máxima.
Para calcular a viabilidade celular após o tratamento, subtraia os valores normalizados de um. Usando a equação fornecida, calcule o coeficiente de interação perturbagen. Imagens de sobreposição fluorescente de transmissão de colonoides em oito horas indicaram que apenas os colonoides tratados com interferon gama mais TNF alfa foram positivos para sinal fluorescente.
Em 24 horas, os colonóides tratados com interferon gama mais TNF alfa exibiram grandes regiões positivas para sinal fluorescente com uma clara quebra na morfologia do colonoide. Os níveis de morte celular em oito horas foram baixos para colonoides de controle de BSA, com um ligeiro aumento nas condições tratadas com TNF alfa. Em 24 horas, os colonoides tratados com interferon gama mais TNF alfa mostraram os maiores níveis de morte celular.
Os valores do IPC indicaram leve sinergismo em oito horas e sinergismo substancial em 24 horas. Isso confirmou uma interação sinérgica dependente do tempo entre o interferon gama e o TNF alfa.
