Para começar, pegue células de câncer epitelial de ovário de camundongo cultivadas. Remova o meio de cultura das placas de Petri e lave duas vezes com DPBS. Adicione 20 mililitros de Dulbecco's Modified Eagle Medium sem FBS e solução de penicilina-estreptomicina.
Incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Em seguida, colete o sobrenadante da cultura de células de 20 placas de Petri de 15 centímetros de diâmetro. Centrifugar a 300 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius e recolher o sobrenadante.
Centrifugar o sobrenadante a 2 000 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius e recolher o sobrenadante para remover os detritos celulares. Agora ligue a bomba de vácuo e conecte-a à entrada de ar do sistema de filtragem a vácuo. Filtre o sobrenadante através da membrana de polietersulfona de 0,22 mícron para remover vesículas ou impurezas maiores que 0,22 mícrons.
Adicione 15 mililitros do sobrenadante filtrado ao tubo interno do tubo de ultrafiltração de 100 quilodaltons. Centrifugue a 3.500 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o líquido do tubo externo.
Em seguida, colete o líquido do tubo interno. Adicione um mililitro de DPBS ao tubo interno. Pipete repetidamente para ressuspender os exossomos e, em seguida, colete-os.
Centrifugar o líquido a 10 000 g durante 60 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga de encaixe rápido de seis mililitros e sele-o com um selador térmico. Abrir o tubo após ultracentrifugação do sobrenadante durante duas horas.
Uma vez removido o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de DPBS para obter a solução do exossomo.