Para começar, obtenha uma placa de cultura com colônias de Methylomonas espécies LW13. Inocular as colônias em seis mililitros de meio de sais minerais de nitrato em um tubo de vidro. Sele o tubo com uma rolha de soro e vedação de crimpagem de alumínio.
Adicione metano usando uma seringa para criar uma atmosfera final de 50% volume por volume de metano no ar. Agite esta cultura líquida planctônica a 200 rotações por minuto em temperatura ambiente até ficar turva, o que leva cerca de um dia. Passe as culturas líquidas na proporção de um para 10 em meios frescos.
Continue cultivando as culturas líquidas de metanotróficos para registrar o crescimento de fase, atingindo uma densidade óptica de 600 nanômetros de aproximadamente 0,5. Para preparar a seringa, remova os êmbolos que a acompanham e coloque-a em um recipiente estéril. Conecte uma ponta de filtro estéril de politetrafluoretileno ou PTFE a cada seringa e coloque a seringa em um rack de tubo de ensaio padrão com a ponta voltada para baixo.
Em seguida, misture um mililitro das células com cinco mililitros de meio de sais minerais de nitrato e quatro mililitros de agarose derretida em um tubo cônico estéril. Despeje lentamente a mistura de agarose na seringa até a marca de oito mililitros e deixe solidificar. Após aproximadamente 15 minutos, tampe a seringa com uma rolha de borracha butílica estéril de 20 milímetros.
Prenda as rolhas com fita adesiva e rotule a seringa. Em seguida, encha uma seringa grande de 60 mililitros com 100% de metano e conecte uma ponta de filtro de PTFE conectada a uma agulha estéril de calibre 23. Fure a rolha de borracha da seringa com a mistura de agarose com uma seringa grande e insira uma segunda agulha estéril como saída de gás.
Pressione o êmbolo da seringa grande para permitir que 20 mililitros de metano a 100% sejam liberados pelo espaço da cabeça. Remova a agulha de saída quando houver um a dois mililitros de metano na seringa para evitar o refluxo de oxigênio. Incube a seringa com a mistura de agarose e metano a 18 graus Celsius.
Para extrudar a agarose, substitua a ponta do filtro de PTFE por uma agulha estéril de calibre 23 e a rolha de borracha pelo êmbolo da seringa fornecido. Pressione lentamente o êmbolo para dispensar incrementos de um mililitro em tubos de microcentrífuga estéreis separados de 1,5 mililitro. A cepa LW13 do tipo selvagem formou uma faixa horizontal distinta em uma profundidade específica na seringa de gradiente, onde as concentrações de metano e oxigênio eram baixas.
LW13 inoculado em seringas gradientes mostrou um contra-gradiente metano-oxigênio com depleção de metano e consumo de oxigênio correspondentes à profundidade da banda horizontal. O mutante de deleção OAT de LW13 não tinha a formação de banda horizontal distinta observada na cepa do tipo selvagem, indicando o papel do gene neste fenótipo.
