Para começar, obtenha os segmentos de agarose extrudados de seringas de gradiente, inoculados com espécies de metilomona selvagens ou mutantes, LW13. Adicione 0,75 mililitros de cloreto de sódio a 0,85% em água à amostra de agarose extrudada e homogeneize por vórtice. Além disso, dilua a amostra de 1 a 10 em um novo tubo de microcentrífuga com 900 microlitros de solução salina.
Incube as amostras com três microlitros de uma mistura de um para um de SYTO 9 e manchas de iodeto de propídio no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos. Para determinar as células por mililitro de agarose, sonicar a suspensão de esferas de contagem de microesferas em banho-maria por cinco minutos. Em seguida, adicione 10 microlitros da suspensão à amostra antes da análise por citometria de fluxo.
Analise as amostras usando um citômetro de fluxo. Compare a dispersão lateral versus os gráficos de operação dispersos para frente entre amostras de controle sem células e amostras de agarose inoculadas para desenhar portas de tensão de evento bacteriano que excluem partículas de agarose de fundo. Para contar as unidades formadoras de colônias dentro da seringa de gradiente, adicione 800 microlitros de meio de sais minerais de nitrato ao segmento de agarose extrudado e vórtice por 10 segundos para auxiliar na pipetagem.
Prepare uma placa estéril de 96 poços com 180 microlitros de meio de sais minerais de nitrato em cada poço. Adicione 20 microlitros de amostra de agarose diluída a cada poço na primeira coluna e misture. Usando uma pipeta multicanal, dilua em série 20 microlitros de amostras dez vezes, começando pela primeira fileira de poços.
Rotule a placa quadrada de grade contendo nitrato, sais minerais, sem-fim ou meio de sua escolha. Usando uma pipeta multicanal, coloque cinco microlitros de uma coluna da placa de 96 poços na placa helicoidal. A citometria de fluxo usando as amostras extrudadas de agarose confirmou que o mutante de deleção OAT de LW13 mostrou crescimento celular reduzido em comparação com a cepa do tipo selvagem.
A complementação do mutante com o gene OAT restaurou o número de células e a formação de bandas a níveis semelhantes ao tipo selvagem, indicando o papel específico do gene na formação de bandas.
