Para começar, coloque colágeno, hidróxido de sódio, água ultrapura estéril, 10 vezes PBS, um tubo de microcentrífuga, ácido hialurônico metacrilato e o fotoiniciador no gelo. Em seguida, coloque as inserções de cultura de tecidos na placa e rotule-as. Para preparar três miligramas por mililitro de solução de colágeno, combine colágeno de alta concentração, um hidróxido de sódio normal, água ultrapura e 10 vezes PBS.
Adicione componentes ao tubo de microcentrífuga e mantenha a ponta da pipeta submersa ao misturar para evitar a formação de bolhas. Depois disso, centrifugue as células a 200 G por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova cuidadosamente o excesso de mídia da parte superior de cada solução de condição celular, deixando o volume de mídia necessário para a condição.
Coloque essas soluções no gelo. Adicione o volume calculado de solução de colágeno a cada solução de condição celular. Em seguida, adicione o volume calculado de ácido hialurônico metacrilato a 1%, seguido de 17 miligramas por mililitro LAP em cada solução de condição celular.
Misture cada tubo de condição, um de cada vez, mantendo a ponta da pipeta submersa para evitar a formação de bolhas e adicione 100 a 150 microlitros a cada inserto de cultura de tecidos. Agora ligue a lâmpada ultravioleta de 385 nanômetros em uma corrente constante. Para fazer uma reticulação de cada gel, exponha cada poço à luz ultravioleta por 45 segundos, um de cada vez.
Em seguida, coloque a placa a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos para reticular o colágeno. Usando um meio basal astral com 0,5% e dois volume por volume e 1% volume por volume B27 sem vitamina A, aplique a cabeça de pressão do fluido aos géis. Adicione mídia à placa do poço e às inserções de cultura de tecidos para fluxo líquido zero.
Coloque a placa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por pelo menos 18 horas ou até cinco dias.
