Para começar, coloque as imagens saudáveis e degeneradas dos olhos da mosca da Drosophila na mesma pasta. Certifique-se de que os arquivos sejam nomeados adequadamente para identificar os grupos experimentais e distinguir entre machos e fêmeas. Abra o software Ilastik.
Clique em Criar novo projeto. Em seguida, em Outros fluxos de trabalho, selecione Contagem de densidade de células e selecione um local para salvar o arquivo de projeto. Sequencialmente, clique em 1.
Inserir dados, Adicionar novo e Adicionar imagens separadas para escolher a imagem padrão. Em seguida, clique em 2. Seleção de recursos e selecione os recursos.
Escolha mais valores sigma para aumentar a sensibilidade. Clique em 3. Contando e defina o valor sigma de primeiro plano como 5,00.
Usando a ferramenta de primeiro plano, marque 50 ou mais omatídeos individuais na imagem padrão. Clique em 3. Contando novamente e use a ferramenta de fundo para marcar a área fora do omatídio.
Desenhe linhas verdes em forma de treliça ao redor do omatídio. Clique em 4. Exportação de densidade e escolha Exportar configurações de imagem para ajustar as configurações de imagem.
Em seguida, clique em Informações do arquivo de saída e selecione o formato tiff para análise posterior no Flynotyper. Clique em 5. Processamento em lote, selecione arquivos de dados brutos e selecione todas as fotos experimentais de moscas a serem analisadas.
A lista de imagens importadas a serem analisadas é vista em Selecionar arquivos de dados brutos. Clique em Processar todos os arquivos na parte inferior do 5. Seção de processamento em lote.
Depois que o software concluir o processamento, verifique a pasta que contém as imagens experimentais do olho da mosca. Confirme se as imagens pretas nomeadas, suas probabilidades de nome de exemplo, estão presentes. No ImageJ, abra o arquivo tiff gerado pelo Ilastik.
Use a ferramenta de seleção de retângulo para criar um retângulo ao redor do olho. Selecione Control X ou Control C para cortar a área e aguarde até que uma caixa preta na forma do contorno do retângulo apareça. Sequencialmente, clique em Arquivo, Novo e Área de Transferência Interna para abrir o olho de mosca cortado.
Para salvar o olho de mosca cortado como JPEG, clique em Arquivo, Salvar como e JPEG. No ImageJ, clique em Plugins e Flynotyper. Em Genótipos, selecione Adicionar genótipos e abra a pasta que contém as imagens de olho de mosca cortada.
Marque as caixas Microscópio de luz e Verticalmente. Em seguida, em Classificar Ommatídio por, marque as caixas Estabilidade e Distância até o centro. Para o número de omatídeos classificados considerados, defina a entrada como 200.
Clique em Executar e aguarde até que os resultados da análise apareçam. Copie e cole o arquivo de amostra e o P-score no software estatístico para análise posterior. As imagens oculares de Drosophila processadas com Ilastik e analisadas sob luz de anel mostraram padrões omatídicos mais claros em comparação com aquelas sem luz de anel, melhorando a avaliação qualitativa.
A análise do flynotyper indicou pontuações fenotípicas significativamente mais altas nos olhos de mosca moderada e severamente degenerados em comparação com os olhos não degenerados. Quando o Ilastik não foi usado, os escores P entre olhos não degenerados e moderadamente degenerados foram semelhantes.
