Para começar, pegue células U2OS cultivadas com 60% a 70% de confluência e divida-as usando 0,25% de tripsina-EDTA. Prepare placas de 60 milímetros adicionando lamínulas redondas de 13 milímetros. Placa 400.000 células em uma placa de 60 milímetros contendo várias lamínulas redondas de 13 milímetros.
Em seguida, remova o meio de cultura das placas. Adicionar meio de cultura contendo 25 etoposídeo micromolar e incubar as células durante 20 minutos, 1 hora e 3 horas. Após a incubação, remova o meio das placas.
Lave as células com PBS três vezes. Para fixar as células, adicione metanol gelado em volume suficiente para cobrir a superfície da lamínula e incube por 10 minutos a 20 graus Celsius. Em seguida, lave as lamínulas com PBS três vezes e transfira-as para uma câmara de umidade.
Depois de retirar o PBS, adicione 30 a 40 microlitros de tampão de permeabilização e incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, lave as lamínulas três vezes com PBS. Em seguida, toque no PBS das amostras.
Adicione 30 a 40 microlitros de solução de bloqueio fornecida no kit PLA a cada lamínula. Incube a placa em uma câmara de umidade pré-aquecida a 37 graus Celsius por 1 hora. Agora dilua os anticorpos primários no diluente de anticorpos fornecido no kit.
Depois de retirar a solução de bloqueio, adicione a solução de anticorpo primário a cada lamínula e incube a quatro graus Celsius durante a noite em uma câmara de umidade. Diluir as sondas negativas e positivas de um a cinco no diluente de anticorpos. Use combinações como Burro anti-Mouse MENOS com Burro anti-Cabra PLUS e Burro anti-Rato MENOS com Burro anti-Coelho MAIS.
Agora, retire a solução primária de anticorpos e lave uma vez com TBST. Depois de retirar o excesso de TBST, adicione 20 microlitros da solução de sonda PLA às lamínulas. Em seguida, incube na câmara de umidade pré-aquecida a 37 graus Celsius por 1 hora.
Dilua o tampão de ligação 5x em água de alta pureza. Retire a solução de sonda PLA e lave uma vez com TBST. Agora, adicione ligase à solução de ligação na diluição de 1:40 imediatamente antes de aplicá-la às amostras.
Incube na câmara de umidade pré-aquecida a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, dilua o tampão de amplificação 5x em água de alta pureza. Uma vez que a solução de ligação é removida das amostras, lave as amostras uma vez com TBST.
Adicionar a polimerase à solução de amplificação em diluições de 1:80 imediatamente antes de a aplicar às amostras. Incube na câmara de umidade pré-aquecida a 37 graus Celsius por 100 minutos. Retire o tampão de amplificação e lave duas vezes com tampão SSC por 10 minutos cada.
Depois de lavar as amostras duas vezes com PBS, adicione a solução de anticorpo primário a cada lamínula e incube em temperatura ambiente por 1 hora. No final da incubação, retire a solução de anticorpo primário e lave três vezes com TBST. Em seguida, adicione a solução de anticorpos secundários a cada lamínula e incube em temperatura ambiente por 20 minutos.
Em seguida, lave cinco vezes com TBST, duas vezes com tampão SSC e duas vezes com tampão SSC 0,01x. Por fim, adquira imagens de diferentes poços ou regiões de lamínulas para evitar artefatos devido à incubação não homogênea, e salve todos os canais com o mesmo padrão de nome.
