Depois de realizar a aquisição de pontos PLA para localizar a interação da proteína, abra imagens de diferentes condições Para ajustar os parâmetros para análise no ImageJ. Determine e especifique esses parâmetros junto com os dados no programa de macros. Para remover o plano de fundo, clique em Processar e subtrair plano de fundo.
Use a função de visualização para testar diferentes raios de bola rolante. Para remoção de ruído, clique em Processar, Ruído e Remover manchas. Em seguida, clique em Processar e suavizar no menu do núcleo para aplicar a função de suavização e melhorar o preenchimento.
Agora, clique em Imagem, depois em Tipo e selecione 8 bits para converter em uma imagem de 8 bits. Depois disso, ajuste o limite acessando Imagem, Ajustar e, finalmente, Limiar. Ajuste o limite para visualizar todos os núcleos ou pontos na imagem, evitando a supersaturação e o colapso das estruturas.
Além disso, observe os valores e teste em imagens diferentes. Para converter em uma máscara, clique em Processar, Binário e Converter em máscara. Para o núcleo, clique em Processar, Binário e Preencher furos, seguido de Processo, Binário e Bacia hidrográfica.
Para os pontos PLA, clique em Processo, Binário e Bacia Hidrográfica. Para contar núcleos, meça a área ou o comprimento dos diferentes núcleos para estimar o tamanho médio. Use um valor aproximado para analisar partículas clicando em Analisar e Analisar partículas.
Defina o tamanho para 15 infinito e marque as opções. Mostrar máscara, exibir resultados, limpar resultados, adicionar ao gerenciador e excluir nas bordas. Para contar os pontos do PLA, meça sua área ou raio para estimar seu tamanho médio.
Para cada ROI no gerenciador de ROI, clique em Analisar e Analisar partículas. Defina o tamanho para 0,02 a 3. Marque as opções, mostrar máscara, exibir resultados, limpar resultados, resumir e excluir nas bordas.
Salve os resultados mostrando o número de pontos por núcleo em cada núcleo presente na imagem. A interação Nek4 Ku70 aumentou no núcleo após danos ao DNA após 20 minutos, uma hora e três horas de tratamento com etoposídeo em comparação com as células controle e tratadas com DMSO. O tratamento com etoposídeo aumentou significativamente a interação Nek5 topoisomerase 2-beta em comparação com o controle DMSO.
A coloração gama-H2AX aumentou após 20 minutos de tratamento com etoposídeo e permaneceu elevada por até três horas, indicando resposta sustentada a danos no DNA.
