Para configurar o ensaio cinético para os peptídeos RBPR2 e STRA6, dilua em série os peptídeos RBPR2, RBPR2 e STRA6 mutantes do camundongo no tampão de corrida. Abra o software de controle e selecione o assistente Kinetic SOAR Affinity. Na caixa de diálogo da sequência de injeção, selecione Caminho de fluxo 2.1 com a célula de fluxo 2 como ativa e a célula de fluxo 1 como referência.
Na caixa de diálogo de configuração, marque a opção executar ciclos de inicialização, insira a solução como buffer, especifique o número de ciclos e clique em Avançar. Agora vá para a caixa de diálogo de parâmetros de injeção e insira os parâmetros da amostra, como tempo de contato de 120 segundos, vazão de 30 microlitros por minuto e tempo de dissociação de 300 segundos. Para parâmetros de regeneração, defina a solução de regeneração para ácido clorídrico glicina com um tempo de contato de 30 segundos e uma vazão de 30 microlitros por minuto e clique em Avançar.
Na caixa de diálogo de amostras, insira os nomes dos peptídeos, pesos moleculares e concentrações e clique em Avançar. No diálogo de posição do rack, atribua os peptídeos diluídos como amostras individuais de 120 microlitros com várias concentrações de um a 100 micromolares para as posições designadas no rack. Clique em ejetar rack e insira todos os frascos.
Depois, clique em Avançar e, na caixa de diálogo preparar o protocolo de execução, clique em Iniciar. Insira um nome de arquivo e clique em salvar. Agora no software, clique no menu Iniciar e selecione uma avaliação.
Abra o arquivo e, no menu suspenso de seleção, escolha FC-2.1 para analisar o sensorgrama ativo subtraído em branco da célula de referência para as fases de associação e dissociação dos peptídeos msRBP4, msRBPR2 mutante e msSTRA6. Em seguida, clique no botão suspenso Cinética ou Afinidade e escolha Limite de superfície. Na caixa de diálogo selecionar curvas, marque incluir coluna na tabela e clique em Avançar.
Agora vá para a caixa de diálogo de seleção de dados, visualize os sensorgramas subtraídos em branco. Clique em Cinética e afinidade. Mantenha os parâmetros padrão e clique em ajustar para ajuste de curva.
Inspecione a guia de relatório para constante de dissociação de equilíbrio Kd, taxa de associação Ka ou Kon e taxa de dissociação Kd ou Koff. Salve o sensorgrama de dados cinéticos na guia de texto em formato limitado e use os valores para plotar gráficos.
