Para começar, enuclee os globos oculares do camundongo sacrificado e homogeneize os olhos em um tampão gelado. Centrifugar o homogenato a 16 000 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante contendo proteínas solúveis em água e outros contaminantes.
Em seguida, ressuspenda e solubilize a membrana peletizada e as proteínas da membrana em um tampão por uma hora a quatro graus Celsius em uma plataforma rotativa. Em seguida, centrifugue a fração de membrana resolubilizada por uma hora a 16.000 G a quatro graus Celsius. Misture o sobrenadante com 30 a 50 microlitros de esferas de anticorpos Rho1D4 e esferas de anticorpos de imunoglobulina G em branco em duas amostras independentes separadas e incube por uma hora a quatro graus Celsius em uma plataforma rotativa.
Usando um suporte magnético, separe o pull-down coletando as contas. Descarte o sobrenadante e lave as esferas com um tampão de sal alto e baixo contendo propano Bis-tris, cloreto de sódio e N-dodecil-beta-D-maltosídeo. Para eluir a proteína rodopsina, incube as esferas por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente com um tampão de 65 microlitros da composição dada.
Em seguida, usando um côvado de quartzo retangular submicro de 50 microlitros com uma abertura de dois milímetros e comprimento de caminho de 10 milímetros, analise o eluato para absorbância de 200 nanômetros a 800 nanômetros em uma configuração de varredura rápida com um espectrofotômetro. Para validar e determinar a qualidade, expor o eluído à luz forte durante um minuto. Em seguida, repita a medição da absorbância.
Subtraia a absorbância em branco e calcule a proporção dos espectros absorventes analisados. Em seguida, plote os espectros absorventes subtraídos em branco e calcule o valor da opsina livre. Depois, usando a lei de Beer-Lambert, calcule a concentração de rodopsina, calcule a concentração de opsina livre de ligante e estime a diferença na concentração de apo-opsina e opsina livre de ligante em quantidade e porcentagem.
