Para começar, gere assemblóides marcados com vírus usando organoides cerebrais específicos do destino. Para preparar reagentes para pré-tratamento de superfície MEA, dissolva 0,5 gramas de pó de enzima detergente em 50 mililitros de água deionizada. Vortex a mistura completamente até que o pó esteja totalmente dissolvido e esterilize a solução usando um filtro de vácuo superior de tubo estéril dentro do gabinete de biossegurança.
Dilua 500 microlitros da polietilenomina a 7% ou solução estoque de PEI com 49,5 mililitros de tampão borato 1X para preparar uma solução de PEI a 0,07%. Para esterilizar a solução, filtre-a através de uma unidade de filtro de 0,22 micrômetro dentro do gabinete de biossegurança. Em seguida, dispense um mililitro da solução enzimática detergente a 1% para cada poço de uma placa MEA estéril e incube-o a 37 graus Celsius por duas horas.
Em seguida, remova a solução enzimática detergente de cada poço e lave os poços cinco vezes com 1,5 mililitros de água deionizada estéril por poço. Encha cada poço com um mililitro de meio de cultura para pré-condicionamento. Coloque as placas MEA de volta em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois dias.
Após a incubação, remova o meio de cultura dos poços e adicione 50 microlitros de solução de PEI a 0,07% para cobrir os eletrodos MEA para revestimento primário. Incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, aspire completamente a solução de PEI de cada poço.
Lave cada poço três vezes com um mililitro de água deionizada estéril. Após aspirar a água, seque as placas em temperatura ambiente por 15 minutos no armário de biossegurança com a tampa aberta. Agora cubra a área do eletrodo em cada poço com 50 microlitros de uma a 20 matrizes de membrana basal de volume a volume diluídas em meios de cultura para revestimento secundário.
Coloque as placas MEA de volta na incubadora de 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, aspire a solução de matriz diluída, deixando uma fina camada na superfície. Se uma camada espessa se formar, borrife a área de contato do eletrodo com força com meio de cultura usando uma ponta de pipeta P1000.
Em seguida, usando uma ponta P1000 com um corte largo, colete um assembloide do prato e coloque-o cuidadosamente em cima dos eletrodos em um poço enquanto transfere o mínimo de mídia possível. Coloque a placa sob um microscópio de dissecção em uma capela de fluxo laminar e, usando uma ponta estéril P 20, empurre cuidadosamente o assembloide para o local desejado. Use uma ponta P 20 para remover o excesso de líquido ao redor do assemblóide.
Após a incubação, remova a placa da incubadora. Em seguida, observando em microscópio de dissecação, aplicar duas a três pequenas gotas de uma a 50 matrizes de membrana basal diluídas em meios de cultura sobre os assemblóides e retornar a placa à incubadora por mais 30 minutos. Em seguida, adicione cuidadosamente três gotas de meios de cultura próximos aos assemblóides usando um microscópio de dissecação.
No dia seguinte, verifique se os assemblóides se acomodaram e se estabilizaram sob um microscópio de dissecação. Adicione 750 microlitros de meios de cultura para elevar o volume total a um mililitro por poço e deixe a placa intacta por pelo menos dois dias na incubadora. Toda semana, remova cuidadosamente 500 microlitros de meios de cultura de cada poço e introduza 700 microlitros de meios basais neurofisiológicos em cada poço.
O aumento da duração da explosão da rede foi observado no dia 92 em comparação com o dia 78, provavelmente devido à maturação dos neurônios. A atividade de celular e rede desapareceu lentamente no dia 125.
