Para começar, incube a solução de triglicina a 60 graus Celsius. Remova três tubos de tiras de pellets RPA do freezer. Bata suavemente os tubos de tira contra a bancada do laboratório para desalojar os pellets brancos.
Transfira todos os três pellets para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro A. Pipete 25 microlitros de água livre de nuclease para enxaguar qualquer pó de RPA restante nos tubos de tira. Transfira a solução de enxágue para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro B.Em seguida, adicione 10 microlitros da solução de triglicina molar de 0,57 e 10 microlitros de mistura de primer ao tubo da mistura principal B.Após o vórtice e a rotação do tubo, coloque-o no gelo. Em seguida, adicione 28,4 microlitros do tampão RPA cinco vezes ao tubo de mistura principal B.Misture bem batendo forte ou agitando várias vezes.
Transfira os pellets coletados no tubo A para o tubo de mistura principal B e inverta o tubo ou bata no fundo do tubo com o dedo várias vezes para misturar. Observe se a solução parece homogênea e monofásica. Coloque o tubo no gelo.
Em seguida, adicione 0,71 microlitros de transcriptase reversa e 2,84 microlitros de RNase H ao tubo da mistura principal. Bata suavemente ou inverta o tubo de mistura principal para cima e para baixo várias vezes. Gire brevemente o tubo antes de colocá-lo no gelo.
Agora, aliquote 8,4 microlitros da solução master mix para 10 tubos pré-resfriados de 1,5 mililitro e coloque os tubos no gelo. Após a alíquota, coloque os tubos em uma prateleira de metal submersa em nitrogênio líquido para prepará-los para a liofilização. No liofilizador, verifique as temperaturas do coletor e da prateleira.
Agora, cubra os tubos abertos no rack de metal com uma folha de papel branco de limpeza. Coloque o rack de metal junto com os tubos abertos na prateleira do liofilizador e feche a porta da prateleira. Em seguida, selecione o programa desejado e pressione Iniciar.
Após 30 minutos da etapa de secagem secundária, pressione parar. Libere a pressão abrindo a válvula de liberação de vácuo. Depois de remover o rack da prateleira, tampe os tubos imediatamente.
