Para começar, cubra as placas de 24 poços com a solução de revestimento e incube por duas horas a 37 graus Celsius ou durante a noite em temperatura ambiente. Lave as placas duas vezes com água estéril e guarde-as em temperatura ambiente até que as células estejam prontas para o revestimento. Agora pegue uma seção do jejuno do cavalo e coloque-a em solução fria de ringer no gelo.
Retire uma porção de 10 centímetros do jejuno e abra-a na borda antimesentérica, posicionando as regiões não linfóides no centro. Em seguida, corte a porção em uma seção de aproximadamente sete por sete centímetros e enxágue bem o tecido em solução de ringer fresca antes da dissecção. Agora prenda o tecido em uma placa de Petri revestida com elastômero de silicone em solução de ringer frio, ou PBS, com o lado da mucosa para cima, enquanto estica o máximo possível.
Usando uma pinça curva, remova as vilosidades intestinais e, em seguida, remova a camada de lâmina própria da região não linfóide de aproximadamente cinco por cinco centímetros. Em seguida, com uma tesoura de microdissecação, remova a submucosa em uma folha, liberando-a em um canto. Observe a separação natural enquanto descasca a submucosa da camada muscular circular interna.
Em seguida, pique a camada submucosa coletada em pedaços de dois a cinco milímetros. Coloque-os em um tubo cônico de 50 mililitros, contendo cinco mililitros de orgono sem FBS, colagenase, protease e BSA. Incube o tecido por duas a três horas a 37 graus Celsius para digestão enzimática.
Após a incubação, adicione 10 mililitros de orgono em temperatura ambiente com FBS para interromper a ação da enzima. Pipetar a mistura de tecidos para cima e para baixo 15 vezes utilizando uma pipeta serológica de 10 mililitros para dissociar as células do tecido. Em seguida, centrifugue a mistura a 3000 g por três minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mililitros de PBS à temperatura ambiente, pipetando a solução 15 vezes para cima e para baixo com uma pipeta serológica de 10 mililitros. Centrifugar o tubo cónico a 3000 G durante três minutos à temperatura ambiente. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de orgono em temperatura ambiente com FBS pipetando para cima e para baixo 15 vezes.
Em seguida, filtre as células sequencialmente através de um filtro de células de tamanho de poro de 100 micrômetros, 70 micrômetros e 40 micrômetros. Depois de centrifugar as células e descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em um mililitro de orgono com FBS. Em seguida, core as células com azul de tripano para identificar células vivas e contá-las usando um hemocitômetro.
Agora semeie aproximadamente 400.000 células em 300 microlitros de orgono com FBS em cada poço de uma placa de 24 poços. Adicione cinco microlitros de N2, cinco microlitros de G5 e 10 microlitros de B27 a cada poço. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para permitir a adesão celular.
Quando as células da primeira passagem atingirem 70 a 80% de confluência, exponha os poços a zero, 10 e 25 nanogramas de interleucina-1 beta por 24 horas. Células fusiformes consistentes com a morfologia glial entérica foram observadas nas culturas, com pleomorfismo e contaminação mínima de outros tipos celulares.
