Para começar, cubra as bulas Transwell com 42 microlitros de 0,05% de Matrigel. Incube por uma hora a 37 graus Celsius para permitir que o Matrigel endureça. Aspirar o meio extra e secar os transpoços durante 30 minutos descobertos.
Em seguida, adicione 200 microlitros de meio DMEM F12 a cada inserção e armazene a 37 graus Celsius até o uso. Lave os rissóis Matrigel contendo os organoides com PBS. Exponha-os a 500 microlitros de recuperação celular enquanto estiver no gelo e pipete a mistura repetidamente para garantir uma coleção completa de células em um tubo de 15 mililitros.
Em seguida, centrifugue o tubo a 300g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular no volume alvo da célula-tronco epitelial intestinal ou do meio IESC. Agora, pré-revestir uma seringa de um mililitro em meio IESC, aspirar a suspensão celular através de uma agulha de calibre 16.
Em seguida, substitua a agulha de calibre 16 por uma agulha de calibre 28 e ejete a suspensão para promover a separação dos organoides. Em seguida, coloque 200 microlitros da suspensão celular resultante no lado apical dos Transwells revestidos. Adicione 500 microlitros de meio IESC e fatores de crescimento ao lado basal.
Use uma câmara de medição TEER de eletrodo duplo para quantificar o TEER nas monocamadas. Encha o copo de cultura com 1,5 mililitros de meio IESC e certifique-se de que exatamente 200 microlitros de meio estejam presentes no inserto Transwell, para que os níveis de fluido coincidam durante a medição. Exponha o aspecto basolateral das inserções de Transwell a citocinas inflamatórias de interleucina-1 beta ou produtos gliais de culturas expostas à interleucina-1 beta.
Meça o TEER a cada 10 a 15 minutos por 45 minutos, colocando cada Transwell no copo de cultura. A exposição basolateral a meios de culturas gliais tratadas com 10 e 25 nanogramas de interleucina-1 beta aumentou significativamente a permeabilidade da barreira epitelial. Nenhum aumento significativo na permeabilidade epitelial foi observado após a exposição à interleucina-6 equina em várias concentrações.
