Para começar, colete o tecido ovariano da sala de cirurgia após a biópsia em um tubo contendo cinco mililitros de 1X DPBS suplementado. Usando um bisturi estéril, corte um pequeno pedaço de tecido ovariano de cerca de dois milímetros cubos da superfície do ovário. Em seguida, mergulhe o tecido em 350 microlitros da solução de Bouin em temperatura ambiente por duas horas.
Após a incubação, lave o tecido com etanol 70% três vezes. Após a inclusão e secção dos tecidos, realizar a coloração de hematoxilina e eosina e adquirir imagens digitais para análise. Abra os arquivos usando o software apropriado, como o QuPath.
Arraste o ficheiro para a janela principal do QuPath e defina o tipo de imagem para Campo claro H&E. Defina um milímetro a partir do epitélio da superfície utilizando a barra de escala. Clique na ferramenta de elipse e anote os folículos.
Conte o número de folículos dentro dessa área de um milímetro desde o estágio de maturação primordial até o primário. Insira o ID da amostra, idade, número de folículos para cada lâmina, espessura da seção e seção N contada na planilha chamada Folículo em milímetro cúbico no arquivo Excel da Calculadora Folículo Z-Score. Depois de identificar os 10% maiores folículos em cada seção contada, clique na ferramenta de linha e desenhe duas linhas perpendiculares através da membrana do oócito.
Selecione Medir e clique em Mostrar medidas de anotação para determinar o diâmetro médio desses oócitos. Registre as medições na coluna rotulada comprimento em micrômetros. Insira o diâmetro médio do oócito dos maiores folículos de 10% em micrômetros para cada lâmina no arquivo Excel da Calculadora Follicle Z-Score.
Coloque a imagem no centro da tela no QuPath e clique no ícone ImageJ. Em seguida, selecione Enviar instantâneo para o ImageJ. No ImageJ, demarque um milímetro da borda usando a ferramenta pincel e clique em Imagem, depois em Tipo e selecione 8 bits.
Em seguida, clique na ferramenta de linha e desenhe uma linha na barra de escala. Selecione Analisar, depois Definir escala, insira o comprimento indicado na barra de escala no campo Distância conhecida e clique em OK. Em seguida, clique em Imagem, ajuste Brilho/Contraste e selecione Automático. Agora clique em Imagem, ajuste o Limite e selecione Automático.
Clique na ferramenta varinha, selecione a área e pressione Ctrl M.Insira o valor da área no arquivo Excel da Calculadora Folículo Z-Score. Depois que todos os dados forem tabulados no arquivo Excel da Calculadora Folículo Z-Score, Vá para a planilha chamada Folículo Z-Score por Milímetro Cubo no mesmo arquivo Excel para determinar se há reserva ovariana reduzida. O epitélio superficial do ovário de uma criança era claramente visível, com a reserva ovariana residindo abaixo dele após o procedimento de coloração.
A densidade folicular foi usada para calcular os escores Z da reserva ovariana, com um escore Z menor que 1,7 negativo indicando reserva ovariana reduzida.
