Para começar, desidrate o explante ósseo osteocondral coletado de ovelhas em um frasco de vidro de 40 mililitros contendo 25 mililitros de solução de desidratação. Coloque os frascos para injetáveis em uma roda giratória por uma hora em temperatura ambiente. Após a última lavagem, substitua a solução de desidratação por 25 mililitros de xileno.
Coloque os frascos de vidro na roda giratória por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 10% de peróxido de benzoíla, 10% de ftalato de dibutila e 450 microlitros de N, N-dimetilanilina diluída de 1 a 20 em propanol e coloque o frasco de vidro a menos 20 graus Celsius durante a noite. Agora, coloque o explante em um molde de incorporação de tamanho médio em uma caixa de plástico.
Despeje a solução de metilmetacrilato de peróxido de benzoíla dibutil ftalato N, N-anilina no molde. Ventile o molde com fluxo de nitrogênio por cinco minutos. Feche a caixa hermeticamente e coloque-a a quatro graus Celsius por 48 horas para polimerização e endurecimento do MMA.
Após dois dias, remova a resina contendo o explante do molde. Corte o bloco de polimetilmetacrilato contendo o explante usando uma serra diamantada ao longo de seu eixo longo para gerar uma seção de 1,5 milímetro de espessura a 3000 RPM com uma velocidade de três milímetros por minuto. Moa a seção com papel de carboneto de silício com números crescentes.
O carbono reveste a seção grossa com um filme de carbono de 10 nanômetros. Monte a seção em um topo de alumínio. Em seguida, crie uma ponte de tinta prateada entre o topo da seção e o toco para permitir a evacuação do carregamento de elétrons para o solo.
Coloque o stub no estágio de microscopia eletrônica de varredura, ou SEM. Feche a câmara e inicie um vácuo. Ligue o feixe de elétrons e ajuste as configurações de SEM para operar no modo de elétrons retroespalhados.
Defina os padrões de nível de cinza para 25 para carbono, 225 para alumínio e 253 para silício. Depois de calibrar o MEV com os padrões, adquira imagens da amostra no modo de elétrons retroespalhados. Use a imagem de elétrons retroespalhados da amostra para converter os níveis de cinza em conteúdo de cálcio.
Em seguida, plote o conteúdo de distribuição de cálcio da imagem. Coloque a seção no palco do microespectrômetro Raman. Calibre o número de onda para precisão e alinhe o laser antes da medição.
Para coletar os espectros Raman, use um laser de 785 nanômetros a 30 miliwatts. Defina o tempo de integração para 20 segundos, repita três vezes e use uma faixa espectral de 350 a 1.800 por centímetro com uma classificação de 1.200 linhas por milímetro. Uma vez calibrado o sistema de nanoindentação, coloque a amostra no sistema óptico e identifique o local da nanoindentação.
Em seguida, mova a amostra sob o dispositivo de recuo. Defina a profundidade de indentação para 900 nanômetros com uma velocidade de carga e descarga de 40 milímetros por minuto e uma pausa de 15 segundos entre carga e descarga. Defina o coeficiente de cosseno para o tecido ósseo para 0,3 e inicie a nanoindentação.
