Para começar, prepare as nanopartículas de RNA de fita dupla de quitosana para alimentar as larvas do bicho-da-seda. Em seguida, escolha larvas de bicho-da-seda de quinto ínstar recém-mudadas de tamanho semelhante para o experimento de alimentação. Coloque cada larva individualmente em um poço de uma placa de seis poços.
Cubra o prato e deixe as larvas morrerem de fome por 24 horas. Em seguida, lave as folhas frescas de amoreira com água deionizada e seque-as com papel de cozinha limpo. Corte as folhas totalmente secas em discos de folhas de um centímetro por um centímetro.
Dissolva as nanopartículas de dsRNA de quitosana em água livre de nuclease a uma concentração de 500 nanogramas por microlitro antes de usar. Cubra 10 microlitros de nanopartículas de dsRNA de quitosana, controle de nanopartículas de quitosana e dsRNA nu separadamente na superfície de cada disco de folha de amoreira. Deixe as soluções secarem ao ar nos discos foliares à temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, ofereça um disco de folha revestido com nanopartículas ou dsRNA para cada larva todos os dias. Uma vez que o disco foliar revestido esteja totalmente consumido pelas larvas, a cada dia, forneça folhas frescas de amoreira. No sexto dia, coloque as larvas no gelo até que fiquem imóveis.
Para dissecar as larvas, corte o tórax com uma tesoura em uma placa de Petri limpa e use uma pinça para retirar o intestino médio. Depois de remover o conteúdo. lave o intestino médio em uma placa de Petri com água livre de nuclease.
Congele o intestino médio a 70 graus Celsius negativos em um tubo de 1,5 mililitro. A alimentação de nanopartículas de dsRNA de quitosana em bichos-da-seda resultou em uma redução de 79% nos níveis de transcritos de BmToll9-2 em comparação com os tratamentos de controle. As larvas de bicho-da-seda tratadas com nanopartículas de dsRNA de quitosana silenciadoras de BmToll9-2 foram visivelmente menores do que as larvas de controle.
Os casulos das larvas silenciadas do BmToll9-2 também foram significativamente menores do que os do grupo controle.
