Esta pesquisa foi possível graças a um prêmio de carreira National Science Foundation (MCB-0746066, caracterização de ativadores de transcrição que regulam o comportamento emergente) para RDW Somos gratos a LJ Shimkus, Goldman BS, Suen G., Singer M., Welch LG, Murphy KA, e Taylor HG para discussões úteis e comentários sobre o manuscrito.

Suprimentos necessários: <ul><li> Klett metros </li><li> Pipeta e dicas </li><li> 2,5 ml tubos de microcentrífuga </li><li> Microcentrífuga </li><li> CTTYE mídia: <ul><li> Casitone 1,0% (Difco Laboratories), extrato de levedura 0,5% (Difco Laboratories), </li><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> TPM mídia: <ul><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> Agarose </li><li> Banho-maria regulado a 55 ° C </li><li> Microscópio de lâminas de vidro </li><li> Grandes lamínulas de vidro </li><li> 2 x 2 cm, 0,5 mm de espessura de silicone junta de borracha (Grace Bio-Lab Inc.) </li><li> Parafilme (ou fita rotulagem) </li><li> Fórceps </li><li> Pequenos grampos da pasta </li><li> Micro-amostragem de pipetas (Fisher) </li><li> 100 gorjeta de copo descartável mL (Fisher) </li><li> Kimwipes </li></ul> Parte 1: preparação celular Comece por criar um ambiente estéril. <ul><li> Local de trabalho limpo, luvas don, e gravador de luz. </li></ul><ol><li> Iniciar uma cultura de células durante a noite através da inoculação em um frasco contendo caldo CTTYE e incubadas no escuro a 32 ° C, sob agitação vigorosa. </li><li> Uma vez que a cultura atingiu uma densidade de 5 x 10 8 células / ml, pipetar 1 ml de células em um tubo de microcentrífuga de 2,5 ml. </li><li> Pellet células por centrifugação por 2 min a 16.000 xg (ou velocidade máxima). </li><li> Decantar e descartar o sobrenadante. </li><li> Lavar pellet celular com 1 ml TPM (sal equilibrada, nutritiva livre de mídia). <ul><li> re-suspensão e vortex </li></ul></li><li> Re-pellet células girando por 2 min a 16.000 xg (ou velocidade máxima). </li><li> Decantar e descartar o sobrenadante. ETAPA CRÍTICA </li><li> Completamente re-suspender pellet em 100 mL de mídia TPM usando uma combinação de pipetagem e vórtice. IMPORTANTE: Este passo garante que não existem aglomerados de células deixadas no tubo. Isso pode demorar um pouco. </li><li> Definir as células de lado em temperatura ambiente enquanto prepara os pratos ensaio de monitoramento. </li></ol> Parte 2: Preparação Agar <ol><li> Prepare 50 ml de ambos TPM (teste de mídia) e CTTYE (disco nutritivo) meios de comunicação. </li><li> Adicionar 0,5 g de agarose a cada (agarose é menos de difracção de agar). </li><li> Autoclave para esterilizar. </li><li> Após a esterilização, manter a media de 55 ° C em uma incubadora (ou banho-maria) durante a construção dos complexos placa de monitoramento do ensaio. </li></ol> Parte 3: Construção Disk Nutritivo <ol><li> Coloque uma junta de borracha estéril 0,5 mm de espessura de silicone em cima de uma chama-esterilizados lâmina de vidro, formando um pequeno poço. </li><li> Pipeta ~ 300 ml dos 55 ° C CTTYE media / agarose para o bem criado pela junta sobre a lâmina e que contém o disco nutritivo. A mídia CTTYE / agarose deve monte acima. </li><li> Coloque um slide chama esterilizados (sem junta) no topo da mídia CTTYE / agarose. IMPORTANTE: Este slide deve ser estabelecido em um ângulo para evitar a formação de bolhas. </li><li> Uma vez que o slide está no lugar, apertar o complexo juntamente com grampos da pasta mini - um de cada lado. </li><li> Coloque o complexo cortada a 4 ° C e permitir que a mídia CTTYE / agarose para definir. Isso geralmente leva cerca de 5 min. </li></ol> Parte 4: Preparação de Ensaio Tracking - Configurar Placa Complexos Montar os componentes, preparar os complexos de slides, coloque o disco nutritivo, despeje a mídia TPM / agarose, complexos de chapa separada e seca, as células da placa, e montar complexos de monitoramento da placa de ensaio. Montar componentes placa complexo <ol><li> Para cada complexo, chama esterilizadas uma lâmina de vidro </li><li> Coloque uma junta autoclavado em cima do slide e reserve (esterilizado lado para cima). Isto irá formar a parte inferior do ensaio. </li><li> Chama esterilizar uma tampa de vidro slip e colocá-lo em cima de um segundo slide de vidro de microscópio envolto com fita rotulagem (ou Parafilm) e reserve (esterilizado lado para cima). Isso é usado como um slide de apoio para manter as lamelas de rachar. Isto irá formar a parte superior do ensaio. </li><li> Chama esterilizar uma lâmina de microscópio terceiro copo e reserve (esterilizado lado para cima). Isso será usado para achatar a agarose. IMPORTANTE: Certifique-se que as juntas formar uma vedação com o vidro pressionando-o com uma pinça, caso contrário, a mídia / agarose pode secar. </li></ol> P<html> rendas disco nutritivo IMPORTANTE: As etapas de 5 a 10 deve ser feito para um complexo de lâmina de cada vez, caso contrário a mídia / agarose poderia começar a solidificar, resultando em qualidade de filme ruim. <ol start="5"><li> Remover o formulário de disco nutritivo complexo de 4 ° C (etapa 5 da parte 3) e erguer para além dos slides expondo a CTTYE agora solidificados / agarose. </li><li> Remover um 1 &#39;disco nutritivo&#39; mm de diâmetro da mídia CTTYE / agarose bem descrito acima, usando uma pipeta de amostragem micro-com uma ponta de vidro 100 ml descartáveis ​​e coloque-o no poço criado pela junta na lamínula (passo 3 acima) . </li></ol> Preparar placas ETAPA CRÍTICA <ol start="7"><li> Pipeta ~ 300 ml dos 55 ° C TPM media / agarose para o bem criado pela junta na lamínula e que contém o disco nutritivo. A mídia TPM / agarose deve monte acima. ETAPA CRÍTICA </li><li> Coloque o slide chama esterilizadas sem junta (a partir do passo 3) no topo da mídia TPM / agarose. IMPORTANTE: Este slide deve ser estabelecido em um ângulo para evitar a formação de bolhas. </li><li> Uma vez que o slide (a partir do passo 5) estiver no lugar, apertar o complexo juntamente com grampos da pasta mini - um de cada lado. </li><li> Coloque o complexo cortada a 4 ° C e deixe o media / agarose para definir. Isso geralmente leva cerca de 5 min. </li></ol> Pratos separados e secos IMPORTANTE: Para evitar que o media / agarose de secar, os passos 11 a 20 só deve ser realizada em um complexo de lâmina de cada vez. IMPORTANTE: Para melhores resultados, os passos 11 a 13 deve ser realizada a 4 ° C. <ol start="11"><li> Uma vez que a media / agarose tem, retire a grampos da pasta e aperte o final do complexo para soltar o slide tape-embrulhado. </li><li> Remove o slide envolto em fita e colocá-lo no banco para uso posterior. ETAPA CRÍTICA </li><li> Utilizando uma pinça como uma cunha, separe os lamínula / junta / media / agarose complexo a partir do slide de apoio (sem junta) e descartar slides de apoio. IMPORTANTE: Não use um movimento para separar os curiosos lamínula / complexo junta. Isto poderia resultar na quebra lamínula e / ou a degola media / agarose para o slide apoio. </li><li> Coloque a lamínula / junta / media / agarose complexo no slide tape-envolvido (a junta lateral-se) e remover a partir de 4 ° C. Coloque este complexo próximo a um queimador para permitir que toda a umidade evapore visível a partir do recém-expostas superfície media / agarose - não mais de 1 min. IMPORTANTE: Não deixe que a seca media / agarose por muito tempo, pois isso pode impactar o M. xanthus comportamento enxame. </li></ol> Células da placa ETAPA CRÍTICA <ol><li> Uma vez que o excesso de umidade tenha evaporado, pipetar 0,5 mL das células concentrado (passo 8 da parte 1) sobre a mídia / agarose aproximadamente 1 mm de distância do disco de nutrientes. IMPORTANTE: É extremamente importante certificar-se que as células são depositadas movendo a pipeta para baixo e depois para cima. Isso garante que o enxame será circular. IMPORTANTE: É extremamente importante para não tocar a ponta da pipeta para a mídia / agarose. Isso fará com que uma depressão na superfície e mudar o comportamento do M. xanthus enxame. DICA: Pressione a ponta da pipeta antes de se aproximar a mídia / agarose. Isso permitirá que uma gota de células para aparecer na parte inferior da ponta da pipeta e tornar mais fácil para depositar as células. </li><li> Quando as células são depositadas, coloque o seguinte complexo para o queimador para permitir que o local de célula para secar - não mais de 20 seg. </li></ol> Montagem do ensaio <ol><li> Uma vez que o local de células secou, ​​alinhar o complexo slide / junta (a partir do passo 1) com a junta sobre a lamínula / junta / media / agarose / celular complexo (a partir do passo 13) e pressione suavemente para formar uma vedação. ETAPA CRÍTICA </li><li> Limpe as superfícies da lâmina e cobrir com um slip Kimwipe para remover os resíduos deixados pelo Parafilm. O ensaio completo deve se parecer com a Figura 1. </li><li> Coloque o complexo de slides concluída no palco aquecida mantida a 32 ° C (deslizar para baixo, cubra escorregar) imediatamente após limpar abaixo (passo 15) para evitar a condensação formando formulário. Se a condensação se formou, vamos sentar complexa de slides no palco aquecida durante alguns segundos antes de iniciar o software de aquisição de imagem. </li><li> Escolha o objetivo apropriado (2X, 4X ou 10X). </li></ol> Parte 5: Preparação Filme t &quot;STEP&gt; CRÍTICA <ol><li> Ligue a câmera e microscópio, e verificar os níveis de luz (certifique-se a luz não é muito intensa). Inicie o computador e abra o programa de aquisição de imagem. </li><li> Clique na janela de imagem ao vivo e foco do microscópio. A imagem deve ser semelhante ao observado na Figura 3. Observe a superfície do ágar uniforme. </li><li> Começar a adquirir as imagens. ETAPA CRÍTICA </li><li> Verifique regularmente o foco durante a primeira hora, como a mídia / agar tende a resolver fazendo com que o foco para drift. </li><li> Limpar a área de trabalho. </li><li> Uma vez que a aquisição da imagem está completa, transferir as imagens adquiridas para o armazenamento e quebrar o complexo slide por imersão em etanol 90% durante a noite. </li><li> Juntas autoclave para reutilização. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ilustração dos desenhos animados do complexo placa TM. (A) mostra a complexa placa básica TM em vista explodida e seção transversal. (B) mostra o uso de juntas maiores. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Aglomerado de Microscopia. Cada nó microscópio (inset) consiste de um microscópio Nikon E400, objetivos, uma fase aquecida, uma câmera Insight, e um computador notebook. Cada nó é interligados em rede e ligados a um computador do controlador mestre. Dois dos nodos são criados com recursos de fluorescência, que consiste da fonte de luz e duas persianas EXFO Uniblitz. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Uma imagem de 20X de aparelhos de ensaio de monitoramento em tempo = 0. Barra de escala, 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Adaptabilidade do complexo placa TM. (A) uma imagem de 100X de M. xanthus deslizando sobre motilidade CTTYE em ágar 1,0%. (B) uma imagem de 20X de P. aeruginosa twitching motilidade. (C) uma imagem de S. 20X marcescens swarming motilidade. Ambos (B) e (C) foram testadas em LB em ágar 1,0%. (D) uma imagem de 40X de M. smegmatis deslizante motilidade em ágar LB em 0,5%. Esta imagem foi capturada usando a configuração de ensaio alternativos visto na Figura 1B. Vídeo 1. Um vídeo time-lapse de um enxame submetido ao ensaio de monitoramento. Video 2. Um vídeo time-lapse de um M. xanthus enxame onde 1% das células são fluorescente etiquetado. Alternando imagens de contraste de fase e fluorescentes foram capturados e sobrepostos para elucidar a posição de células fluorescentes dentro do enxame. Este vídeo foi capturado em CTTYE em ágar 1,0%. Vídeo 3. Um vídeo de lapso de tempo de M. xanthus motilidade deslizamento. Este vídeo foi capturado em CTTYE em ágar 1,0%. Video 4. Um vídeo de lapso de tempo de P. aeruginosa twitching motilidade. Este vídeo foi capturado em LB em ágar 1,0%. Video 5. Um vídeo de lapso de tempo de S. marcescens swarming motilidade. Este vídeo foi capturado em LB em ágar 1,0%. Video 6. Um vídeo de lapso de tempo de M. smegmatis deslizante motilidade. Este vídeo foi capturado em LB em ágar 0,5% utilizando a configuração do ensaio alternativa visto na Figura 1B.

<ol>
	<li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm.">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li><li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation.">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li><li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein.">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li><li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+surface+migration,+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging.">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li><li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure.">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li><li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients.">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li><li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus.">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li><li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus.">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li><li>Bustamante, V. H., Mart&#237;nez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals.">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Lapso de tempo microcinematography (TM) tornou-se uma abordagem padrão para estudar a motilidade procarióticas 2-7. Tradicionalmente, a TM é realizado usando mechas de papel de filtro, pastilhas de ágar fina, ou placas de ágar como substrato 8-11. Estes métodos são adequados e de custo eficaz quando usado para gerar seqüências de imagens para ilustrações geral do movimento bacteriano. No entanto, se seqüências de imagens deve resultar na geração de dados reprodutíveis e quantitativa...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.0% Casitone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% yeast extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-sampling pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;l glass disposable tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Lab Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

recording multicellular behavior in myxococcus xanthus biofilms using time-lapse microcinematography

Um enxame da δ-proteobacterium Myxococcus xanthus contém milhões de células que funcionam como um movimento coletivo, coordenando através de uma série de sinais para criar complexos, padrões dinâmicos como uma resposta a estímulos ambientais. Estes padrões estão a organizar-auto e emergentes, não pode ser prevista observando o comportamento das células individuais. Usando um lapso de tempo de ensaio de rastreamento microcinematography, identificamos um padrão distinto emergente em M. xanthus chamado quimiotaxia, definido como o movimento dirigido de um enxame de um gradiente de nutrientes em direção a sua fonte de 1. A fim de caracterizar de forma eficiente via quimiotaxia lapso de tempo microcinematography, desenvolvemos um altamente complexo placa modificáveis ​​(figura 1) e construído um cluster de 8 de microscópios (Figura 2), cada um capaz de capturar vídeos de lapso de tempo. O ensaio é rigoroso o suficiente para permitir a replicação consistente de dados quantificáveis, e os vídeos resultantes nos permitem observar e acompanhar as mudanças sutis no comportamento enxame. Uma vez capturados, os vídeos são transferidos para um computador de análise / armazenamento com memória suficiente para processar e armazenar milhares de vídeos. A flexibilidade desta configuração tem se mostrado útil para vários membros da M. xanthus comunidade.

Watch this Scientific Journal Video about Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography at JoVE.com

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Para estudar<em&gt; Myxococcus xanthus</em&gt; Swarm comportamento, criamos um protocolo microcinematography lapso de tempo que podem ser modificados para ensaios diferentes. Emprega condições de crescimento padrão adaptado para microscopia, e produz resultados reproduzíveis pelo uso de barato, juntas de silicone reutilizável. Temos utilizado este método para quantificar a quimiotaxia multicelulares.

Comportamento de gravação em multicelulares Myxococcus xanthus Os biofilmes usando lapso de tempo Microcinematography

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of ...

recording-multicellular-behavior-myxococcus-xanthus-biofilms-using

Research

JoVE Journal

Biology

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

12.2K visualizações.  University of South Carolina (USC). Para estudar Myxococcus xanthus Swarm comportamento, criamos um protocolo microcinematography lapso de tempo que podem ser modificados para ensaios diferentes. Emprega condições de crescimento padrão adaptado para microscopia, e produz resultados reproduzíveis pelo uso de barato, juntas de silicone reutilizável. Temos utilizado este método para quantificar a quimiotaxia multicelulares.

Vídeo: Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

Biologia

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...