Nós gostaríamos de agradecer o financiamento do National Institutes of Health (R15-03 para GM065444 LB) e do Programa de Pesquisa Intramural do National Institutes of Health (NIH) e do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (KO). Um prêmio NSF (DBI-0923402) financiou a aquisição do microscópio confocal LSM700. Gostaríamos também de agradecer a assistência geral e comentários úteis sobre o manuscrito do Dr. Andy Ouro. Crédito vai para todo o C. elegans comunidade para a partilha de recursos, protocolos e idéias.

1. Culturas nematóide <ol><li> Obter o C. apropriado elegans tensão da Genética Caenorhabditis stock Center (CGC) ou de um colega. </li><li> Nematóides crescer em placas de agar NGM semeados com um gramado OP50 bacteriana (3). Para a análise da GFP crescimento cepas a 25 ° C é recomendado. </li><li> Um dia antes de sua experiência de microscopia, pegar pelo menos 40 L4 larvas em placas sem sementes e colocar as placas a 25 ° C durante a noite. Esses vermes serão os jovens adultos para o experimento. </li></ol> 2. Injeções Se é desejável para ver estruturas como lisossomos ou mitocôndrias, os adultos podem ser injetados com corante fluorescente antes da visualização. <ol><li> Prepare almofadas injeção secas agarose. (Isto pode ser feito um a muitos dias antes) <ol><li> Prepare fundido agarose 2% em água. Com uma pipeta Pasteur colocar 2 gotas sobre uma lamela 22X54 milímetros. Coloque outro lamela transversalmente no topo da gota. Para atingir a espessura adequada, pressione no lamela superior até o diâmetro do bloco é em torno de 1,5 cm. Deixe descansar por 5-10 minutos. </li><li> Remover lamela superior. Desidratar o bloco de agarose, colocando-o em um forno de 80 ° C por 1 hora ou deixe descansar na bancada durante a noite. </li></ol></li><li> Prepare Mitotracker ou solução Lyso Tracker. <ol><li> Diluir agente fluorescente no buffer Egg. Normalmente usamos uma diluição de 1:10 de Mitotracker ou Lyso Tracker. </li><li> A agulha de injeção é feita de um vidro de 1,2 OD capilar. Puxe a agulha de injeção usando um extrator de agulhas. </li><li> Use uma pipeta Pastuer puxado para trás preencher a agulha com o corante diluído. </li><li> Coloque em uma agulha de luz sem câmara, umidificado até o uso. </li></ol></li><li> Injeção de pré-: Configurando o microscópio e agulha. <ol><li> Monte agulha de injeção para aparelhos de injeção. Nosso aparelho é um micromanipulador Narishige acionamento direto montada no palco de um microscópio invertido Nikon TE200 equipado com capacidade de imageamento DIC. </li><li> Conecte a agulha para um tubo de 1,2 milímetros ID que é conectado ao regulador de pressão. Tanto de ar comprimido ou nitrogênio pode ser usado como uma fonte de pressão externa. Ajuste o regulador de 20-25 psi. </li><li> Coloque 2 gotas de óleo mineral pesado (óleo de parafina) para o bloco de injeção. </li><li> Coloque a almofada de injeção para o microscópio e inferior a agulha no óleo. Verifique para ter certeza de que os fluxos líquidos livremente a partir da agulha, quando a pressão é aplicada. Aplique a pressão de injeção e observar se fluido flui para fora da agulha. Se não, você terá que quebrar delicadamente o fim da agulha. A agulha pode ser quebrado por dirigir com cuidado a ponta em um pequeno pedaço de lamínula quebrado colocados no bloco de injeção. Após a agulha está fluindo, passar para a próxima etapa. </li></ol></li><li> Injeção. <ol><li> Aproximadamente 1 hora antes da exibição de embriões, a transferência de vermes adultos jovens para a queda do petróleo no bloco de injeção. Realizar esta transferência usando o microscópio de dissecação. Use uma platina pegar verme fio com uma ponta aguda para worms transferência. </li><li> Organizar 3-10 vermes para que eles estão mentindo diretamente no teclado. Injectável, é mais fácil se os vermes estão alinhados paralelamente uns aos outros e um pouco menos de um comprimento de vermes separados. Uma vez que os vermes estão no bloco de injeção é importante para o trabalho rapidamente e concluir o processo antes da injeção de worms perecer de dessecação. </li><li> Coloque a lamínula com worms no palco do microscópio do microscópio de injeção. Foco na parte central (ráquis) do tubo gônadas distal. Então use o micromanipulador para mover a ponta da agulha para o mesmo plano focal. Mover o palco horizontalmente para que o worm é perfurado pela agulha. Uma vez que a ponta da agulha está dentro da coluna vertebral, aplique pressão e permitir que a gônada para encher com a mistura de corante. Injetar ambos os braços das gônadas de todos os worms na almofada da injeção. </li><li> Após a injeção, use uma pipeta Pasteur puxado para entregar cerca de 0,5 ml de tampão de ovo para os vermes. Isto irá mantê-los de morrer de desidratação e permitir-lhes recuperar a partir do procedimento de injeção. </li><li> Permitir que os vermes para se recuperar de 1-2 horas em temperatura ambiente com uma luz sem câmara, umidificado. </li></ol></li></ol> 3. Agarose pad para visualização embriões <ol><li> Prepare fundido agarose 2% em tampão Egg. </li><li> Com uma pipeta Pasteur, colocar 3 gotas de agarose fundida em uma lâmina de microscópio limpa. </li><li> Slides lugar entre dois outros slides que têm uma camada de rotulagem fita cobrindo-os. Estes servem como espaçadores que irá garantir que o seu bloco de agarose é a espessura correta. </li><li> Coloque uma lâmina de microscópio limpa segundo perpendicularmente para baixo sobre as gotas de agarose. Pressione para baixo até slide superior repousa sobre fita de slides guia. </li><li> Pouco antes de você está pronto para montar embriões para observação, remover o slide superior. </li></ol><ol><li> Se worms não foram injetados, siga as próximas duas etapas. Caso contrário, pule eles. <ol><li> Escolha vermes adultos jovens da placa que foi preparado no dia anterior. Você deve ser capaz de ver os embriões dentro dos adultos jovens. </li><li> Escolha 50-20 worms em uma placa NGM unseeded. Permitir que os vermes a rastejar na placa unseeded por alguns minutos para que os vermes vão perder a maior parte das bactérias que está preso a eles. </li></ol></li><li> Obtenção de embriões jovens de vermes adultos <ol><li> Colocar uma gota 50-20 mL de tampão de ovo no meio de uma lamela de vidro 18 mm 2 (espessura de 1,5 lamela é preferível). </li><li> Mova worms da placa unseeded ou almofada de injeção na gota de tampão Egg. </li><li> Corte worms aberta com uma agulha hipodérmica calibre 26. Corte para abrir o worm perto da vulva. Você deverá ver embriões espalhe pelo worm. </li></ol></li><li> Montagem em lâmina de microscópio <ol><li> Inverter a lâmina de microscópio que foi preparado com o bloco de agarose e abaixá-lo para a lamínula com embriões. </li><li> Se lapso de tempo prolongado é necessário, usar vaselina para selar as bordas da lamínula para evitar dessecação. </li></ol></li></ol> 5. Microscopia <ol><li> Encontrar os embriões apropriado. <ol><li> Slides lugar para o palco microscópio. Varredura com lente de 10X para encontrar embriões. </li><li> Para encontrar embriões fase inicial, pesquisa de embriões que estão em vias de completar a meiose materna. Meiótica embriões podem ser distinguidos a partir de embriões mais tarde, porque eles não sofreram encurtamento. (Depois de embriões tenham concluído a meiose, é possível ver uma diferença significativa entre a membrana celular e da casca do ovo no final anterior.) </li><li> Depois de ter identificado uma adequada encenado embrião, mover-se para uma lente de maior ampliação para a gravação de embriogênese. </li></ol></li><li> Imagem <ol><li> Neste exemplo, estamos imaginando embriões que expressam a mCherry:: H2B e GFP:: Ub proteínas marcadas. Estamos usando o microscópio de varredura Zeiss LSM700 convencionais laser. </li><li> As imagens são coletados por meio da lente 63X 1.4NA. A 488 e 555 lasers são usados ​​com potência do laser mínimo e máximo ganho. Pilha AZ é coletado a cada 10-15 segundos. Dependendo da extensão da fotodegradação, 30-60 pontos no tempo são coletados. Imagens da pilha Z estão recolhidos em uma imagem de projeção máxima para o vídeo de lapso de tempo final. </li></ol></li></ol> 6. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fertilização para Mitose Primeira C. elegans. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Procedimento de microinjeção. Suplementar Video 1 Time-lapse video da GFP:.. Azul ubiquitina mais Lyso Tracker em um embrião meiótica <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">Clique aqui para ver o vídeo.</a>

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	<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), e833-e833 (2008).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Transgenic+C.+elegans+by+Biolistic+Transformation.">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation.</a> J Vis Exp. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Após a fusão com o espermatozóide, o zigoto sofre uma série de eventos dinâmicos. Estes acontecimentos transformam o ovócito de uma célula relativamente estática em que o embrião se desenvolvendo rapidamente. Em muitos organismos, rearranjos citoplasmática são críticos para o estabelecimento de polaridade embrionárias e para a ativação do ovo. O C. embrião elegans proporciona uma excelente oportunidade para observar esses eventos precoces da ativação do ovo e embriogênese. O embrião é transparente e início de eventos de desenvolvimento ocorrem de forma relativamente rápida após a fertilização. C. pesquisadores elegans tem gerado muitos úteis cepas transgênicas que expressam proteínas fluorescentes marcados envolvidos no início do desenvolvimento. Usando essas cepas, juntamente com RNAi ou mutantes fornece um sistema poderoso para dissecar as vias moleculares que estão na base do desenvolvimento de um organismo multicelular (5, 6, 7, 8). Este artigo vídeo apresenta uma abordagem prática para o uso dessas ferramentas e técnicas para registrar eventos durante a embriogênese no início de C. elegans. O C. madura oócito elegans é preso em prófase da meiose I e é fertilizado na espermateca do hermafrodita adulto. Após a fecundação, o oócito prossegue até o final da meiose I e II. Estes estágios podem ser observados usando fluorescente etiquetado histona H2B (5). Durante a conclusão da meiose materna, o DNA do esperma permanece condensado (ver Figura 1). Após a conclusão da meiose, o DNA materno e paterno se torna descondensada ea forma pronúcleos dois. O pronúcleo materna migra para o pronúcleo paternal e eles se juntam perto do centro do embrião. Mitose rapidamente se segue após reunião pronuclear. Todos esses eventos ocorrem em menos de uma hora. Assim, lapso de tempo microscopia desta seqüência de eventos pode ser facilmente realizado. Realizar esta técnica requer certa facilidade no cultivo de nematóides, bem como habilidades básicas de microscopia para além do acesso a um microscópio confocal. O exemplo aqui apresentado utiliza um C. transgênicos elegans tensão que expressa duas proteínas fluorescentes, GFP:: ubiquitina e mCherry:: H2B. Um microscópio de varredura confocal a laser é usada para observar a localização dinâmica dessas duas proteínas. Além disso, mostramos que a injeção de Lyso Tracker fluorescente etiquetado pode ser usado para seguir o destino dos lisossomos no embrião após a fertilização. Injeção de um tracker rotulados também pode ser realizada para a visualização de concentrações de cálcio mitocôndrias ou local (9). Em teoria, o protocolo de injeção pode ser usado para visualizar qualquer tipo de molécula fluorescente etiquetado no embrião. Isto pode incluir rotulados pequenas moléculas, proteínas, lipídios, etc Em alguns casos, pode não ser necessário para realmente injetar trackers rotulados como os vermes prontamente absorção alguns corantes, como mitotracker (10). No entanto, temos tentado tanto de imersão e injeção de Lyso Tracker e encontraram resultados muito melhores com injeção para visualização em embriões. Considerações técnicas: Os desafios técnicos apresentados com este procedimento incluem a técnica de microinjeção, bem como a dificuldade em embriões de imagem muito cedo. Em relação microinjeções, a espessura da almofada de injeção agarose é fundamental para injeções de sucesso. Se o bloco é muito grosso, as minhocas vão dessicate e morrem rapidamente. Se o teclado é muito fino, os vermes não vai ficar com o bloco durante o processo de injeção. Os embriões podem ser sensíveis às condições ambientais, como temperatura e as condições de buffer. Embriões tipo selvagem deve iniciar descondensação do DNA do esperma e migração pronuclear dentro de um minuto ou assim de completar a meiose II (4). Dentro de 20 minutos, a citocinese primeiro deve começar. Se os embriões são expostos a intensidade do laser muito alta ou estão superaquecidos ou esmagados durante a montagem, este processo pode ser interrompido. Tais embriões vai prender desenvolvimento. Se isso ocorrer, o experimento deve ser repetido com diminuição da potência do laser ou uma espessa almofada de agarose. Embriões C. elegans não secretam sua casca de ovo até pouco depois da fertilização. Durante o curto período de tempo entre a fertilização ea secreção da casca do ovo, os embriões não são viáveis ​​fora da mãe (11). Alguns laboratórios têm evitado este desafio embriões no útero de imagens (5, 12). Utero imagem oferece certas vantagens, tais como a capacidade de capturar eventos que ocorrem durante ou logo após a fertilização. No entanto, esta técnica requer o uso de um sistema de microscopia que permite imagens de tecidos profundos. Sistemas como o de dois fótons ou multi-fotão são especialmente adequadas para este (13, 14). Quando se utiliza um laser convencional de digitalização ou spinning microscópio confocal de disco, as melhores imagens são obtidas de embriões que hafui cortada do verme adulto, como descrito aqui. Considerações do Sistema de imagem: O tipo de sistema de imagem confocal utilizado depende das necessidades dos usuários. Em geral, os sistemas de varredura a laser são recomendadas se que se deseja adquirir imagens com resolução mais alta possível. Por outro lado, os sistemas de disco giratório são mais adequados para os processos de imagem altamente dinâmico como a aquisição de imagens é relativamente rápido e fotobranqueamento fototoxicidade / é reduzida. Os parâmetros de imagem específico irá variar dependendo do desenho experimental e do sistema de imagem confocal empregados. Multidimensional em imagem, é preciso considerar o número de canais, planos focais, e tempo de pontos que estão sendo coletados. Devido aos efeitos limitantes de fotodegradação e fototoxicidade, um número finito de imagens podem ser adquiridas em qualquer experimento. Assim, se você optar por aumentar o número de canais a serem adquiridos, você provavelmente precisará reduzir o número de aviões focal e / ou pontos de tempo e vice-versa. O número total de imagens que podem ser adquiridos serão influenciadas pela intensidade do fluoróforo sendo fotografada, assim como a sensibilidade do microscópio confocal a ser utilizado. Fluoróforos mais intensa e mais sensíveis instrumentos vai exigir menor tempo de exposição e, portanto, produzir menos fotobranqueamento e fototoxicidade. Um grande número ou sistemas de imagem estão disponíveis. Daremos mais detalhes sobre os sistemas que têm sido utilizadas em nossos próprios laboratórios. Para embriões imagem verme girando microscopia confocal de disco, usamos um microscópio Nikon TE2000U invertido equipado com um 60X/1.4 NA Plano de Apo objetivo. O microscópio está ligado a uma unidade de disco Yokogawa CSU10 fiação, uma Hamamatsu C9100-13 EM CCD da câmera, e um Spectral Applied Research LMM5 laser de módulo de mesclagem que contém quatro lasers de estado sólido com saída a 405, 491, 561 e 655 nm. Usando este sistema podemos capturar um ou dois canais, 6-12 planos focais, e 25 a 50 pontos no tempo (entre 30 e 60 segundos de intervalo). Um tempo de exposição típico é de 100 a 200 milissegundos. Para embriões de imagem com laser scanning microscopia confocal, usamos um LSM700 Zeiss equipado com dois canais e quatro lasers de estado sólido (405, 488, 555 e 635 nm). Este sistema é acoplada a um microscópio Zeiss Axio Observer invertido com um Plano de Apo-objetivo 63X/1.4NA usado para imagens de embrião. O sistema utiliza o software Zeiss ZEN para aquisição de imagem, que também fornece processamento de imagem limitada e análise. Quando imagem com dois fluorocromos, que normalmente se reúnem 05/01 planos focais (~ 0,5 m de distância) e recolher uma pilha Z a cada 15 segundos. Coleções são continuou até fotobranqueamento significativa ocorreu. Para gerar o vídeo lapso de tempo final, imagens da pilha Z são consolidadas usando a ferramenta de projeção máxima no software ZEN. Vídeos são exportados a partir do software como arquivos avi.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Composição </th></tr><tr><td> Ovo de buffer </td><td></td><td></td><td> Hepes 5mM pH 7.2, 110mm NaCl, KCl 4 mM, acetato de Mg 5mM, 5mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M-7512 </td><td></td></tr><tr><td> Lyso Tracker </td><td> Invitrogen </td><td> L-7525 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetar injeção capilar </td><td> Harvard Apparatus, Kent, Reino Unido </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha Puller </td><td> Kopf </td><td> Modelo 700C </td><td></td></tr><tr><td> Microinjetor Aparelho </td><td> Tritech Research </td><td> Minj-1 regulador de microinjeção </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse microscopy of early embryogenesis in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans tem sido frequentemente utilizado como um sistema modelo em estudos de início de processos de desenvolvimento. A transparência dos embriões, os recursos genéticos, ea relativa facilidade de transformação são qualidades que fazem C. elegans um excelente modelo para a embriogênese inicial. Baseados em laser microscopia confocal e tags fluorescente etiquetado permitem aos pesquisadores seguir específicos estruturas celulares e proteínas no embrião em desenvolvimento. Por exemplo, pode-se seguir organelas específicas, tais como lisossomos ou mitocôndrias, usando corantes fluorescentes rotulados. Esses corantes podem ser entregues ao embrião por meio de microinjeção no gônadas adulto. Além disso, a localização de proteínas específicas podem ser seguidos usando tags proteína fluorescente. Exemplos são aqui apresentados demonstram o uso de um corante fluorescente lisossomal, bem como fluorescente etiquetado proteínas histonas e ubiquitina. A histona rotulados é usado para visualizar o DNA e assim identificar o estágio do ciclo celular. GFP-tagged ubiquitina revela a dinâmica de vesículas ubiquitinated no embrião. Observações dos lisossomos rotulados e GFP:: ubiquitina pode ser usado para determinar se há co-localização entre as vesículas ubiquitinated e lisossomos. A técnica de microinjeção do corante lisossomal é apresentado. Técnicas para a geração de cepas transgenenic são apresentados em outros lugares (1, 2). Para a imagem latente, os embriões são cortadas de nematóides adultos hermafrodita e montados em blocos de agarose 2% seguido por lapso de tempo em um microscópio de varredura a laser padrão microscópio confocal ou um microscópio confocal disco giratório. Esta metodologia prevê a visualização de alta resolução de embriogênese precoce.

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Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Este artigo descreve uma técnica para a visualização dos eventos iniciais da embriogênese do nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

time-lapse-microscopy-of-early-embryogenesis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

17.9K visualizações.  University of Alabama in Huntsville. Este artigo descreve uma técnica para a visualização dos eventos iniciais da embriogênese do nemátodo Caenorhabditis elegans.

Vídeo: Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

Biologia

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extração de prostaglandina e Análise em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

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