Os autores gostariam de agradecer a Amanda Struckhoff pela ajuda inicial com o experimento. Este trabalho foi financiado por uma concessão do NIH 5RO1CA115706.

1. Preparação da placa revestida com colágeno <ol><li> Diluir colagénio para uma concentração final de 10 ug / ml em OPTI-MEM meios de comunicação. </li><li> Casaco 6 placas de poços com colagénio, pela adição de 1,5 ml a partir do passo 1 a cada poço. Incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, lavar a placa 2 vezes com fosfato 1x salino tamponado (PBS) e armazená-los em PBS. </li></ol> 2. Preparação de células e Sementeira em uma placa de 6 poços Nota: Use a mídia quentes e PBS para garantir condições óptimas para a movimentação das células <ol><li> Crescer MDA-MB-231 (uma linha de células de mama invasivo do cancro) escassamente em Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). Neste exemplo, usamos o MDA-MB-231, no entanto, este método pode ser aplicado a qualquer aderentes cancerosas e não linhas de células cancerígenas. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS 1x quente e recolher por tripsinização. Confira as células sob um microscópio para fazer sure que as células são adequadamente separação por tratamento com tripsina. </li><li> Recolher as células por adição de meio DMEM com 10% de FBS, suavemente girar para baixo as células a 1000 g durante 5 minutos. Ressuspender o sedimento de células suavemente em meio DMEM com FBS 10%. </li><li> Quebre o pellet celular pipetando cima e para baixo com cuidado. É importante para quebrar agrupamentos de células em células individuais, tanto quanto possível. </li><li> Contar as células e diluir até uma concentração final de 50.000 células / ml em meio DMEM com FBS 10%. Pipetar 2 ml em cada poço. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C em um incubador de cultura de tecidos durante a noite, até começar a microscopia de lapso de tempo. </li><li> Para assegurar um amplo espaço para a migração, criar uma ferida utilizando uma ponta de pipeta, lavar a placa com 1X PBS para remover os restos (formado como resultado da ferida) e adicionar DMEM com FBS 10%. Verificar sob o microscópio para células flutuantes. Se um grande número de células são flutuantes, repita o procedimento de lavagem. Agora, o prato está pronto para ser configurado nomicroscópio para aquisição de imagem. </li></ol> 3. Instalação de microscópio e de aquisição de imagens automatizado Existem pacotes de imagem diversos softwares que controlam o microscópio para aquisição automática de imagem. Aqui, usamos Slidebook 5,0 software de imagem automáticos e aquisições são realizadas em um microscópio Olympus (Olympus IX81), acoplado a uma câmera C9100 EM-Hamamatsu, que é excelente para aplicações em células vivas, onde a velocidade de aquisição e fototoxicidade mínima é obrigatória. O sistema inclui um estágio de câmara de controle ambiental superior (Neue Live Cell) e um controlador de fase automatizada XY (Antes Proscan). As imagens são adquiridos com um 10X UPLANFL Ph1/0.30 objectivo, no modo de campo claro, utilizando um intervalo de tempo definido. O protocolo seguinte descreve a aquisição de imagem. <ol><li> Ligue o microscópio, câmara, e um aparelho de imagem ao vivo de células. Posicione a placa sobre o palco microscópico. Cobrir a placa com o meio celular Neue ao vivoambiental câmara de controlo, que está ligado com uma fonte de CO 2 e sensores de temperatura. Ajuste o termostato a 37 ° C e CO2 a 5%. </li><li> SlideBook software permite a seleção objetiva totalmente automatizado, a seleção de comprimento de onda e fácil troca entre as técnicas de campo fluorescentes e brilhantes. Para configurar diferentes parâmetros de controle de foco, aberto software SlideBook&gt; ir para a barra de menu&gt; controle de foco de seleção, clicando&gt; <img alt="Figura 0 Botão 1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn1.jpg" /> e selecione os seguintes parâmetros: <ol><li> Na &quot;caixa objectivo&quot; definir o objetivo da seleção da janela suspensa. Note que estamos usando uma objetiva fase e ter selecionado manualmente o anel de fase apropriado no condensador. Se usando um sistema com um condensador automatizado, este será automaticamente ajustado através do programa de software. Alternativamente, se nem objetiva nem torre condensador são automatizados estes devem ser selecionados de cada manual doly. </li><li> No &quot;Filter Set&quot; caixa: <ol><li> Selecione as configurações para direcionar o caminho da luz, quer ocular ou câmera da caixa suspensa para ver filtros disponíveis (&quot;Live&quot; para ocular &quot;, Widefield&quot; para a câmera em nosso sistema). </li><li> Selecione o filtro apropriado para a iluminação de campo claro (no nosso set-up, esta opção é rotulado como &quot;DIC&quot;, o que representa uma posição aberta para o caminho da luz brightfield). </li><li> Selecione a fonte de luz, clicando em &quot;Abrir brilhante&quot; para abrir o obturador de campo claro. </li></ol></li></ol></li><li> Para visualizar a amostra sob a parte do olho, selecione o filtro de campo claro (posição &quot;6&quot; em nosso sistema) na torre. Depois de inicialmente visualizar a amostra através da ocular para encontrar campos apropriados e levar a amostra em foco (passos 3.2.1 a 3.2.2.3). Mova a torre de filtro para alterar o caminho de luz para a câmera para captura de imagem (posição &quot;1&quot; em nosso sistema). </li><li> A etapa automatizada permite a seleção de diferentes XY coordenaçãotes para capturar vários campos de interesse na aquisição da imagem. Em software SlideBook, vá para o controle de foco, escolha &quot;XY&quot;, selecione posições diferentes embora a parte do olho, em seguida, clique em &quot;set point&quot; de bloqueio em cada local para captura de imagem (Figura 1). </li><li> Afinar o foco da imagem da câmera que é visto na tela. Isto pode ser conseguido por qualquer utilizando os controlos manuais no microscópio ou os controles de computador, que pode ajustar a focagem em incrementos muito mais finas. </li><li> Usando os controles na &quot;Focus Controls&quot; janela, ajustar a posição z do palco. Para melhores resultados, o foco em planos saliências celulares perto o contato com a placa. </li><li> Para ajudar com o foco use o controle deslizante para ajustar os tempos de exposição para a um conjunto adequado para focagem. Se múltiplas posições XY foram selecionados, ajustar o foco para cada posição individual: Sob o controle de foco&gt; XY ponto de visita&gt;. Nota: isto é feito para fazer ª, com certezano campo for correctamente focado para um instantâneo ideal. </li><li> Use o software para configurar os parâmetros da janela de captura. Em SlideBook, abra a captura, selecionando <img alt="Figura 0 Botão 2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn2.jpg" /> na barra de menus. Veja a Figura 2. Em seguida, verifique os seguintes parâmetros. <ol><li> Verifique Capture&gt; tipo de lapso de tempo. </li><li> Verifique conjunto de filtro: campo largo: DIC (para a imagem de campo claro). </li><li> &quot;Captura lapso de tempo&quot; é o número de pontos de tempo que será capturada (que pode variar, dependendo do tipo de célula). Duração é o comprimento total de tempo para a experiência. Unidades de tempo [em milissegundos (ms), segundos (s), minutos (m) ou horas (h)] pode ser selecionado no menu suspenso. </li><li> &quot;Intervalo&quot; é o atraso entre o início de um instante e no início do instante seguinte. Conforme você digita em dois desses valores, o terceiro campo será calculado automaticamente. </li><li> Captura XY múltipla: selecionar &quot;multilista de pontos &quot;para mais de 1 posição XY. </li><li> Nomeie o arquivo. No exemplo dado, temos chamado-lo &#39;231 &#39;. </li></ol></li><li> Para evitar o inesperado desligar do computador devido a várias imagens, use a opção &quot;spool&quot; para salvar o arquivo. É opcional, porém é altamente recomendável. Para este fim, sob captura contro l&gt; selecione Avançado&gt; Spool&gt; Capturar a memória e guardar no arquivo de spool após cada momentos. Navegue até o local para salvar o arquivo do livro slide (Figura 3). O filme gerado pode ser importado depois do local designado. Passos de configuração microscópio foi resumido em <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/Figure_3.1_merged.pdf" target="_blank">arquivo de 3,1</a> . </li></ol> 4. Processamento de Imagens e de Análise da Migração: Cálculo da Velocidade e Deslocamento Neste exemplo, o processamento de imagem é feito por SlideBook 5, 6 5,0 software. Existem vários outros programas como o ImageJ 7 para o processamento e análise de imagem. <ol><li> Importe os arquivos SlideBook gerados a partir de imagens de campos diferentes em momentos diferentes. Vá para a barra de menu&gt; em Image&gt; Import&gt; livro de slides carretel&gt; selecione o arquivo desejado (Figura 4a). </li><li> Aqui nosso objetivo é rastrear o movimento de células individuais. Isso pode ser feito usando o acompanhamento automático ou acompanhamento individual. No exemplo, utilizou-se de controle manual, uma vez que isto facilita a afastar artefactos facilmente, o que é mais difícil com acompanhamento automatizado. </li><li> Abra o arquivo SlideBook, em que temos para realizar monitoramento. Sob o menu: Máscara Select&gt; Protocolo de rastreamento de partículas&gt; Protocolo de Partículas manual de Rastreamento (Figura 4b). Uma janela aparecerá com pontos de início e fim do tempo (Figura 4c). </li><li> Begin para controlar o movimento de células individuais, clicando no centro de cada célula (núcleo). Rastrear cerca de 10 células de cada filme e pelo menos três filmes diferentes devem ser seleccionados a partir de localizações diferentes, de modo que aproximadamente 30 células será analisado a partir de uma experiência. Cada experiência deve ser repetido três vezes. Para permitir uma abordagem imparcial, selecione as células a partir de locais diferentes, como algumas células de frente, meio, etc cantos Clique em &quot;OK&quot;, uma vez rastreamento é feito. </li><li> A migração aleatória pode ser analisado através da medição mudanças etc velocidade, velocidade ou deslocamento Para analisar os dados, em Menu&gt; máscara select&gt; de rastreamento de partículas&gt; protocolo de rastreamento de partículas. Seleccionar os parâmetros de controle, como descrito, a seguir: (Figura 5a): <ol><li> Acompanhe com - Selecione o parâmetro que você deseja monitorar na lista suspensa. Neste exemplo, utilizou-se Center, de Área (as coordenadas do centro do Object). </li><li> Clique em &quot;acompanhar e continuar&quot;. Depois de monitoramento é completo, isto irá avançar automaticamente para a próxima etapa. </li></ol></li><li> Escolha estatísticas desejadas para cada caminho, tais como o deslocamento ea velocidade média (ver Figura 5b): <ol><li> Velocidade Média - a distância total percorrida dividida pelo tempo necessário para percorrer essa distância. </li><li> Cilindrada total - a distância total percorrida pelo objeto. </li><li> Clique em &quot;Calcular e Continuar&quot; se quiser avançar para a próxima etapa, ou simplesmente escolha &quot;Calcular&quot; se você quiser ver as estatísticas, sem passar para a próxima etapa. Um arquivo será gerado que pode ser salvo como arquivo de texto e podem ser posteriormente exportados para o Excel. </li></ol></li><li> A fim de rastrear objetos usando o protocolo de monitoramento automatizado, primeiro uma máscara tem que ser criado. <ol><li> Selecione Mask&gt; Imagem Segmento&gt; uma janela segmento parece&gt; selecione até limite for alcançado tal que setembroarating um objeto a partir de outros&gt; clique em Aplicar&gt; OK (veja a Figura 5c). Passo 4.5.1 é o mesmo. </li><li> Remover Objectos menor do que - Marque esta caixa para remover seletivamente objetos menores que um determinado tamanho. Digite o tamanho no campo de edição e escolha microns ou pixels como unidade. Isto é usado para remover artefatos freqüentemente causadas por detritos. </li><li> Movimento mínimo - introduzir o número mínimo de pontos de tempo que deve ser controlado a fim de determinar um caminho. </li><li> Movimento máximo - Digite o movimento máximo que você espera de um determinado objeto de um ponto de tempo para o próximo. </li><li> Passos para analisar os dados são os mesmos que o rastreamento manual (ver os passos para 4.5.2 4.6.2). </li></ol></li></ol> 5. Os resultados representativos Um exemplo de uma análise de migração aleatória como quantificada em termos de velocidade e de deslocamento (Figura 6). Depois de exportar o arquivo de to excel, os dados são plotados usando uma caixa e enredo bigodes. A análise estatística comparando o deslocamento total e velocidade média entre teste e de controlo é realizada usando teste de Mann-Whitney. A amostra de teste mostra um aumento na velocidade média, em comparação com o controle. A amostra de teste mostra um aumento no deslocamento total, em comparação com o controle. Filme de controlo e de teste: Controle MDA-MB-231 e teste de MDA-MB-231 foram semeadas em células de colagénio durante a noite. Lapso de tempo microscopia de vídeo foi realizada por microscópio Olympus, acoplado a uma câmara EM-Hamamatsu. As imagens são tomadas a intervalos de 1 hora para um total de 18 horas durante a migração aleatória. Por favor, veja Filme 1 e Filme 2 da migração aleatória de controle e amostras de teste. Configuração do microscópio: <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig1.jpg" /> Figura 1. Configurando múltiplos pontos para a imagem<html> capturar. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig2.jpg" /> Figura 2. Passos retratando controle de captura. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig3.jpg" /> Figura 3. Como salvar várias imagens. dflinebreak &quot;&gt; Processamento de imagem e análise de migração. <img alt="A Figura 4a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4a.jpg" /> Figura 4a. Etapas para importar imagens para análise de dados. <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4b.jpg" /> Figura 4B. Passos para analisar os dados usando o protocolo de trajetórias de partículas. <img alt = &quot;Figura 4c&quot; src = &quot;files/ftp_upload/3585/3585fig4c.jpg /&quot; /&gt; Figura 4c. Janela de comprimento caminho que descreve de partículas controladas. Passos da análise de dados. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5a.jpg" /> Figura 5a. Passos retratando parâmetros do protocolo de rastreamento de partículas. <img alt="Figura 5b" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5b.jpg" /> Figura 5b. Selecção de estatísticas de caminho a ser analisado. <img alt="A Figura 5c" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5c.jpg" /> Figura 5c. Passos para criar a máscara para o protocolo de monitoramento automatizado. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig6.jpg" /> A Figura 6 velocidade. Médio (Figura6a) e deslocamento (Figura 6b) é plotado em um gráfico de bigodes. A amostra de teste mostra um aumento da velocidade e do deslocamento como comparar a controlar. Filmes Filme 1. A migração de células de controle. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie1.avi" target="_blank">Clique aqui para ver o filme</a> . Filme 2. A migração de células de teste. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie2.avi" target="_blank">Clique aqui para ver o filme</a> . Controlo MDA-MB-231 e teste de MDA-MB-231 foram semeadas células de baixa densidade em colagénio para durante a noite. Lapso de tempo microscopia de vídeo foi realizada por microscópio Olympus, acoplado a uma câmara EM-Hamamatsu. As imagens são tomadas a intervalos de 1 hora durante 18 horas durante a migração aleatória. Por favor, veja os filmes da migração aleatória de controle e teste.

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Não temos nada a divulgar.

O tempo real ensaio de migração aleatória permite precisas, a análise, sensível dos parâmetros celulares tais como a velocidade de migração e deslocamento. Este método não é restrita ao fim valor da medição do ponto, por isso é mais quantitativa. Uma vez que, as células são monitorizados em meio DMEM com soro normal de, que reduz o efeito deletério de incubação mais longo em soro meios livres. Tem sido demonstrado que a migração de células depende da formatação e quebrando contactos celulares com...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gêmeos Bio-Products </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Colágeno </td><td> BD </td><td> 354231 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio com câmara de celular ao vivo e controlador de fase automatizada XY </td><td> Olimpo </td><td> Olympus 1X81 </td><td></td></tr><tr><td> Câmara de controle ambiental </td><td> Neue </td><td> Neue Câmara Live Cell </td><td> O nosso tem um costume construído com placa retangular de vidro para óptica apropriados através do topo da câmara. A forma rectangular acomoda multi-poços utilizados em muitos dos nossos experimentalts. </td></tr><tr><td> Automated fase XY </td><td> Prévio </td><td> Antes Proscan </td><td> Isto permite que retorno preciso para multiplicar as posições XY seleccionados durante a microscopia lapso de tempo. </td></tr><tr><td> Câmera </td><td></td><td> Hamamatsu EM câmera C9100 </td><td></td></tr><tr><td> Software </td><td> Normalmente adquirido através de fornecedor do microscópio, como Olympus </td><td> Livro Slide 5 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of random migration of cells using time-lapse video microscopy

A migração celular é um processo dinâmico, que é importante para o desenvolvimento embrionário, a reparação de tecidos, a função do sistema imunitário, e invasão tumoral 1, 2. Durante a migração direccional, as células movem-se rapidamente em resposta a um sinal de quimiotáctico extracelular, ou em resposta a estímulos intrínsecas 3 fornecidos pela máquina motilidade de base. A migração aleatória ocorre quando uma célula possui direccionalidade intrínseca baixa, permitindo que as células para explorar seu ambiente local. A migração celular é um processo complexo, na célula resposta inicial sofre polarização e estende-se saliências na direcção da migração 2. Os métodos tradicionais para medir a migração, tais como o ensaio de migração Boyden câmara é um método fácil de medir a quimiotaxia in vitro, o que permite medir a migração como um resultado de ponto final. No entanto, esta abordagem não permite a medição de parâmetros de migração individuais, nem permite a visualização de alterações morfológicas que celular durante a migração. Aqui, apresentamos um método que nos permite monitorar as células migram em tempo real usando o vídeo - microscopia de lapso de tempo. Desde a migração celular ea invasão são marcas registradas de câncer, este método será aplicado no estudo da migração de células cancerosas e invasão in vitro. A migração aleatória de plaquetas tem sido considerada como um dos parâmetros de 4 a função das plaquetas, por conseguinte, este método pode também ser útil no estudo da função plaquetária. Este ensaio tem a vantagem de ser rápida, fiável e reprodutível, e não necessita de optimização de números de células. A fim de manter as condições fisiologicamente adequados para as células, o microscópio é equipado com CO fornecimento 2 e termostato temperatura. O movimento celular é monitorizada por tirar fotografias com uma câmara montada no microscópio em intervalos regulares. A migração celular pode ser calculado medindo a velocidade média e umdeslocamento MÉDIO, que é calculado pelo software Slidebook.

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Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Este método permite a monitorização de células em tempo real e as medições quantitativas de parâmetros diferentes de células, tais como a velocidade de migração, o deslocamento, e velocidade. Ao contrário dos métodos tradicionais, esta abordagem em tempo real não se baseia em medições quantitativas de terminais de migração, em vez disso ele permite o monitoramento e cálculo dos parâmetros diferentes continuamente.

Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

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16.7K visualizações.  LSU School of Medicine. Este método permite a monitorização de células em tempo real e as medições quantitativas de parâmetros diferentes de células, tais como a velocidade de migração, o deslocamento, e velocidade. Ao contrário dos métodos tradicionais, esta abordagem em tempo real não se baseia em medições quantitativas de terminais de migração, em vez disso ele permite o monitoramento e cálculo dos parâmetros diferentes continuamente.

Vídeo: Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

Biologia

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Time-Lapse Vídeo Microscopia de Avaliação da EYFP-Parkin Agregação como um marcador para Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Lente livre de microscopia para a dinâmica e a análise quantitativa de cultura de células aderentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...