O projeto descrito foi apoiada pelo Grant Numbers P01 AI055637 e U54 AI057156 de NIAID / NIH. Seu conteúdo são da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial dos Programas de RCE Office, NIAID, ou NIH.

Dia 1: F. tularensis inoculação placa <ol><li> Culturas prato congelado estoque de F. tularensis em Mueller-Hinton suplementado com 2,5% (vol / vol) de doadores soro bovino, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (wt / vol), glicose e 0,025% (wt / vol) pirofosfato de ferro. Crescer F. tularensis a 37 ° C com 5% de CO 2 por aproximadamente 24 h. </li></ol> Dia 2: F. líquido tularensis inoculação media <ol><li> Preparar e autoclave 1 litro de meio-cação ajustada Mueller-Hinton (contendo 1,23 mM cloreto de cálcio dihidratado e 1,03 mM de cloreto de magnésio hexa-hidratado). Quando resfriado a 37 ° C, médio complementar ainda mais com glicose a 0,1% (wt / vol), pirofosfato de ferro de 0,025% (wt / vol), e 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filtro de esterilizar (0,22 μ) médio em duas alíquotas de 500 ml. </li><li> Retire 12 ml de meio suplementado Mueller-Hinton e transferir para um tubo estéril Falcon de 50 ml. </li><li> Usando um loop de inoculação estéril de 10 mL, raspar uma loopful grande de F. tularensis crescimento de placas de ágar (a partir de dia 1) e bactérias transferência em 12 ml de Mueller-Hinton médio (ver Etapa 2). Vezes solução pipeta múltiplos break-up aglomerações e preparar suspensão bacteriana homogênea. Não vortex. </li><li> Usando uma pipeta estéril, inocular cada navio de 500 ml com 5 ml de suspensão bacteriana a partir da Etapa 3. Crescer culturas caldo a 37 ° C por 14 a 18 h com agitação suave (190-200 rpm em um New Brunswick Innova série 2300 shaker). </li></ol> Dia 3: lise, Spheroplasting osmótica, sacarose e centrifugação em gradiente de densidade <ol><li> Obter F. culturas tularensis da incubadora agitação e retire uma alíquota de 1 ml de cada cultura de 500 ml para verificar as densidades ópticas respectivos. Nós descobrimos que a extração de membrana ideal e resultados de isolamento quando se utiliza F. tularensis células em fase logarítmica iniciais de crescimento, que se correlaciona com uma OD 600 entre 0,2-0,4 (~ 10 julho - 10 agosto UFC / ml). Culturas com uma 600 OD inferior a 0,2 não renderá quantidade suficiente de material da membrana total para gradientes de sacarose subseqüentes. Por outro lado, culturas com uma 600 OD superior a 0,4 (se aproximando da fase estacionária) foram encontrados para o rendimento misto membrana fusões. </li><li> Centrífuga culturas em 7.500 x g por 30 min a 15 ° C para coletar as células. Recomendamos a centrifugação das culturas em quatro garrafas de 250 ml de centrífuga, porque facilita suspensão pellet subseqüentes. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante de mídia de cada frasco de centrífuga e bata as garrafas em papel absorvente para remover excesso de meio de crescimento. </li><li> Dentro de 10 min após a conclusão de centrifugação, suspender cada pellet bacteriano em 8,75 ml de sacarose 0,75 M (em 5 mM Tris, pH 7,5). Todos os quatro pellets bacteriana deve ser suspenso e transferido (35 total de ml de suspensão bacteriana) para um balão de 250 ml estéril (com uma pequena stirbar) dentro de 10 min. </li><li> Enquanto suavemente a mistura da suspensão de células em um stirplate, lentamente, adicione 70 ml (2 volumes), de 10 mM EDTA dissódico (em 5 mM Tris, pH 7.8) ao longo de 10 min. Adicionar a solução de EDTA com a ponta da pipeta abaixo do nível de suspensão de células para evitar elevadas concentrações locais de EDTA. O stirbar deve ser girando a uma taxa suficiente para misturar a suspensão da célula, mas não rápido o suficiente para causar espuma ou formação de bolhas. Após a solução de EDTA foi adicionado, incubar a solução por 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Após a incubação de 30 minutos, lentamente, adicione 11 ml (1 / 10 º volume) de uma solução de lisozima 2 mg / ml a uma concentração final de 200 mg / ml. Continue a misturar a suspensão de células durante a adição de solução de lisozima. Como observado acima, adicionar a solução de lisozima com a ponta da pipeta abaixo do nível de fluido celular suspensão para evitar concentrações elevadas de locais de lisozima. Ações lisozima soluções (2 mg / ml) podem ser preparados em single-use alíquotas e armazenadas a -20 ° C durante três a quatro meses. Incubar a solução resultante por 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Durante a incubação de 30 minutos, prepare um frasco estéril 1L com um pequeno stirbar e 530 ml de temperatura ambiente Cellgro Molecular Grade dH 2 O (4,5 volumes). </li><li> Lisar osmoticamente suspensão de células (a partir da Etapa 6) por diluição lenta (caudal de aproximadamente 11 ml / min) em 530 ml de dH Molecular Grade 2 O (a partir da Etapa 7) ao longo de 10 a 15 min com a mistura suave. Por causa do maior volume de solução nessa etapa, aumentar a velocidade stirbar para assegurar a mistura adequada. O stirbar deve ser girando a uma taxa suficiente para dispersar completamente a suspensão de células, uma vez adicionado ao 2 dH O, mas não rápido o suficiente para levar à formação de espuma ou formação de bolhas. Adicione a suspensão de células com a ponta da pipeta descansando no fundo do frasco, ao lado do stirbar, para facilitar a diluição uniforme do cell de suspensão. Descobrimos que 25 ml-pipetas melhor trabalho durante esta etapa. Acompanhar atentamente o processo de diluição e interromper o fluxo necessário para dispersar acumulações locais de células, aglomerados de células, e tufos de células. Incubar a solução resultante por 30 min em temperatura ambiente. Note que este passo parece ser um dos mais desafiadores e críticos para o sucesso geral do experimento. </li><li> Após a incubação de 30 min, a transferência de 40 alíquotas ml da solução de lise osmótica em 50 ml tubos cônicos e centrifugar a 7500 xg por 30 min a 10 ° C para remover as células intactas e detritos. </li><li> Após a centrifugação, remover cuidadosamente 27-30 ml do sobrenadante de cada tubo cônico e sobrenadantes piscina em um frasco estéril 1L </li><li> Transferir 25 ml do sobrenadante em pool, cada, em 16 tubos de ultracentrífuga e centrifugar a 200.000 x g (44.400 rpm em rotor F50L-8x39 ultracentrífuga FiberLite) por 2 horas a 4 ° C. Note que cada rotor detém 8 tubos, de modo que este passo requer dois rotores e duas ultracentrífugas. Alternativamente, o segundo conjunto de 8 tubos devem ser mantidos a 4 ° C até centrifugado. </li><li> Dentro de 10 min do fim do percurso de ultracentrífuga, prepare modificada tampão de ressuspensão de membrana. Transferência de 8 ml de tampão de suspensão de membrana (25% [wt / wt] sacarose, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) para um tubo estéril e adicionar 1 comprimido de EDTA-free cocktail inibidor da protease e 375 U de Benzonase. Delicadamente misturar a solução para dissolver comprimido inibidor da protease. </li><li> Após ultracentrifugação, cuidadosamente despeje sobrenadantes, inverter os tubos ultracentrífuga em material absorvente, e bata tubos para remover excesso de sobrenadante. Marca a localização de cada pellet de membrana com um marcador para ajudar na visualização. Delicadamente ressuspender oito pellets de membrana com 600 mL cada um tampão modificado membrana ressuspensão. Transferir cada ressuspensão de membrana para o próximo conjunto de oito tubos, delicadamente ressuspender estes oito pellets, eo pool de resuspensions membrana, resultando em um tubo estéril. As membranas são difíceis peletizada para voltar a suspender, por isso continuar passando o buffer ressuspensão modificado membrana sobre a pelota até que as cascas de distância da parede do tubo. Muitas vezes é necessário usar a ponta micropipeta para raspar o pellet membrana fora da parede do tubo e ajuda no processo de ressuspensão. Quando pipetagem, evitar formação de espuma ou formação de bolhas. Note que este passo parece ser um dos mais desafiadores e críticos para o sucesso geral do experimento. </li><li> Quando a membrana de pellets foram ressuspendidos e removidos todos os 16 tubos, lavar todos os quatro tubos com 600 mL de tampão modificado membrana ressuspensão. A lavagem deve ser centrada em torno da área marcada (membrana pellet) de cada tubo. Transferência da lavagem para o tubo de ressuspensão de membrana. Repita a etapa de lavagem para os restantes três conjuntos de quatro tubos. </li><li> Incubar a membrana com a ressuspensão de balanço suave durante 30 min à temperatura ambiente para se degradar DNA e ajuda na redução de material floculantes. </li><li> Remover uma pequena alíquota da suspensão de membrana e realizar a quantificação de proteína de membrana para determinação do rendimento total. Normalmente, preparar puro, 1:1, diluída (em 2,5% SDS), e 1:3 diluído (em 2,5% SDS) amostras de membrana, o calor as amostras a 90 ° C por 10 min, e usar o ensaio de proteína BioRad DC para quantificar a concentração de proteína de membrana ressuspensão. Produção de proteína total é, geralmente, entre 1,0 mg / ml e 1,6 mg / ml. O uso de calor e SDS são obrigados a liberar OMPs das membranas extraídas de forma que um valor de quantificação mais precisa da proteína pode ser obtida. </li><li> Prepare gradientes de sacarose linear por camadas 1,8 ml cada uma das soluções de sacarose (wt / wt, preparado em 5 mM EDTA, pH 7,5) em 14 x 95 mm tubos de Ultra-Clear ultracentrífuga na seguinte ordem: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Camadas de gradientes de sacarose é mais fácil de realizar quando se utiliza um bulbo de pipetador, não uma pipeta automática. </li><li> Com base na quantificação de proteínas da membrana ressuspensão (Passo 16), a camada de 1,5 mg de ressuspensão de membrana no topo de cada gradiente. A cada 14 x 95 milímetros tubo de ultracentrífuga tem uma capacidade máxima de 12,5 ml e, dado que 10,8 ml é contabilizado pelas soluções de sacarose a partir do Passo 17, você não deve carregar mais de 1,7 ml de ressuspensão de membrana por gradiente. Individualmente e pesar cuidadosamente ajustar o peso final de cada tubo gradiente de sacarose (adicionando ou removendo a ressuspensão de membrana), para que todos os tubos o mesmo peso (± 0,01 g). </li><li> Transferência de gradientes de sacarose em um balde de rotor SW-40Ti balançando e centrifugar a 256.000 x g (38.000 rpm) por um período mínimo de 17 horas a 4 ° C. </li></ol> Dia 4: Coleta de frações gradiente de sacarose <ol><li> Após 17 h de centrifugação, parar o processo de centrifugação, e remova cuidadosamente gradientes de sacarose a partir do rotor SW-40Ti. </li><li> Limpar cuidadosamente o fundo do tubo de gradiente de sacarose com etanol 70%, perfurar afundo do tubo com uma agulha de 21G, e recolher seqüencial 500 mL frações do gradiente em tubos de microcentrífuga estéril. Repita o procedimento para gradientes subseqüentes. O gradiente deve ser a escorrer por fluxo de gravidade, de modo a não perturbar o gradiente de sacarose. No entanto, se o gotejamento cessa a partir do fundo do tubo de gradiente, uma pequena quantidade de pressão pode ser aplicada ao topo do tubo com o dedo. </li><li> Determinar o índice de refração de cada fração gradiente de sacarose utilizando um refratômetro e correlacionar o índice de refração com uma densidade específica em g / ml 1. Avaliar a localização de proteínas através da preparação de frações de sacarose representante gradiente (incrementos de densidade de 0,01; de 1,11 g / ml a 1,26 g / ml) para SDS-PAGE de separação, a transferência para nitrocelulose, e immunoblotting. </li></ol> Resultados representante Quando realizada corretamente, este procedimento resulta na separação completa de IM e vesículas OM de ambos Tipo A Tipo (por exemplo, SchuS4) e B (por exemplo, LVS) das cepas de F. tularensis. Como mostrado na Immunoblots representante na Figura 1, F. OMPs tularensis localizar entre as densidades de 1,17 e 1,20 g / ml. Em comparação, PIM localizar entre as densidades de 1,13 e 1,14 g / ml. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Immunoblotting de F. tularensis gradientes de densidade de sacarose. Frações seqüenciais foram coletados a partir de gradientes e densidades (g / ml) foram calculados com base em índices de refração. Proteínas foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para nitrocelulose, e immunoblotted para detectar OMP e fracionamento IMP. mw, prestained padrões de peso molecular, com tamanhos (em kDa) observou, no lado esquerdo de cada blot. LVS, toda lisados ​​celulares de F. LVS tularensis. O correspondente fração sacarose densidades de gradiente são anotados acima de suas respectivas faixas. OMPs e PIM, como observado na margem esquerda, foram detectadas com anti-soros, policlonal monoespecífico. Resultados semelhantes foram obtidos para F. tularensis SchuS4.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo descreve uma variação da lise, spheroplasting osmótica, sacarose e gradiente de densidade centrifugação &quot;padrão ouro&quot; para a separação física e enriquecimento de bactérias Gram-negativas OMs bacteriana de outros componentes celulares 2, 3, 4. Considerando que anteriormente descrita a aplicação deste método para isolar OMs de ambos os tipos A e B Tipo de cepas de F. tularensis 5, esta apresentação oferece um procedimento mais detalhado e otimizado para o isolamento do OM. Na verdade, este é um avanço importante para a identificação de potenciais de superfície exposta e fatores de virulência deste patógeno presuntivo mortal. A importância deste procedimento foi demonstrada em estudos realizados por nosso laboratório mostram que a imunização de camundongos com OMPs purificada de uma protecção substancial contra virulenta Tipo A F. tularensis desafio pulmonar 6. Como observado acima fase de crescimento, das células bacterianas, monitoramento cuidadoso durante a lise osmótica, gentil e ressuspensão de pellets de membrana são passos críticos que parecem estar relacionados com o sucesso / fracasso deste processo de separação de membrana. Enquanto este método otimizado é rigoroso e sujeito a alguma variabilidade experimental, a OMs resultando parecem ser de qualidade notavelmente melhorada em comparação com aqueles obtida a partir do uso de detergentes, cloreto de lítio, carbonato de sódio ou 7, 8, 9, 10, 11, 12.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Donor calf serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>35-022-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IsoVitaleX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>211876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellgro molecular grade dH2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>46-000-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>38.5 ml polycarbonate bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>010-0514</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F50L-8x39 ultracentrifuge rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>096-087051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>04693132001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzonase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>70664-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DC protein assay</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>500-0116</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>344060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SW-40Ti swinging bucket rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>331301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Abbe benchtop refractometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-964-10 </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for the isolation of francisella tularensis outer membranes

Francisella tularensis é um cocobacilo Gram-negativos intracelulares eo agente causador da tularemia zoonose. Quando comparado com outros patógenos bacterianos, a dose infecciosa extremamente baixa (&lt;10 UFC), progressão rápida da doença, e alta morbidade e mortalidade sugerem que as cepas virulentas de Francisella codificam para fatores de virulência da novela. Superfície exposta moléculas, proteínas da membrana externa ou seja (OMPs), foram mostrados para promover a célula hospedeira bacteriana de ligação, de entrada, a sobrevivência intracelular, virulência e evasão imune. A relevância para o estudo de OMPs é ainda mais enfatizada pelo fato de que eles podem servir como vacinas de proteção contra uma série de doenças bacterianas. Considerando OMPs pode ser extraído de bactérias gram-negativas através de técnicas de extração em massa de membrana, incluindo sonicação de células seguida de centrifugação e / ou extração de detergente, estas preparações são freqüentemente contaminados com periplasmic e / ou citoplasmática (interna) de membrana (IM) contaminantes. Durante anos, o &quot;padrão ouro&quot; método para a separação bioquímicos e biofísicos de bactérias gram-negativas IM e membranas externas (OM) tem sido a de bactérias sujeitas à lise osmótica e spheroplasting, seguido por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Uma vez mergulhado em um gradiente de sacarose, OM pode ser separado de mensagens instantâneas com base nas diferenças em densidade de flutuação, acredita-se ser baseada em grande parte, a presença de lipopolissacarídeo (LPS) na OM. Aqui, descrevemos um método rigoroso e otimizados para extrair, enriquecer, e isolar F. tularensis membranas externas e seus associados OMPs.

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Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Um protocolo para a separação de membranas internas e externas da<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; Por lise, spheroplasting osmótica, sacarose e ultracentrifugação em gradiente de densidade.

Método para o isolamento de Francisella tularensis Membranas externas

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

16.9K visualizações.  University of Texas Southwestern Medical Center. Um protocolo para a separação de membranas internas e externas da Francisella tularensis Por lise, spheroplasting osmótica, sacarose e ultracentrifugação em gradiente de densidade.

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A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologia

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

A rápida, Método Scalable para o isolamento, estudo funcional, e Análise de matriz extracelular derivado de celular

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Método padronizado para a esterilização da elevado-produção de sementes de Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Membranas lipídicas de bicamadas tethered para monitorar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro e membranas lipídicas

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.