Agradecemos a Christina Pyrgaki, Tao Tong e Alison North do centro de recursos Bioimaging da Universidade Rockefeller, de assistência e apoio. Agradecemos também Xiphias Ge Zhu para edição de filme. Este trabalho foi apoiado pelo humano Frontier ciência programa organização (PC).

Experimentação e cuidados com animais foram realizadas de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê de uso na Universidade Rockefeller e cuidados institucionais do Animal.
1. tecido preparação
<ol><li>Execute padrão perfusão intracardíaca com ~ 20 mL de 1x solução salina tamponada fosfato (PBS) a 4 ° C até que o sangue é completamente removido do tecido.</li>
	<li>Alterne o perfusato para ~ 20 mL da solução de fixador (paraformaldeído 4% (PFA) em PBS 1x) a 4 ° C até o pescoço e a cauda significativamente foi uma brincadeira. Atenção: O PFA é tóxico. Evite o contacto com a pele, olhos e mucosas. Soluções devem ser feitas dentro de uma coifa.</li>
	<li>Disse as almofadas de gordura de interesse cuidadosamente para retirar o forro de gordura todo sem danificá-lo. Use fórceps sem corte-terminado para evitar comprimir ou apertar o tecido. Evite a contaminação do tecido dissecado com qualquer pele.</li>
	<li>Fixar o tecido em 4% PFA em 1X PBS durante a noite a 4 ° C. Para cada almofada gorda, fixe com ~ 10 mL da solução de fixação em um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Lave o tecido 3 vezes (1h cada) com PBS 1x à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Armazenar o tecido para a curto prazo (até 2 semanas) em PBS 1x a 4 ° C e protegido da luz. Para armazenamento a longo prazo (por exemplo, 1-2 anos), alterne o buffer para 1X PBS com 0,05% de azida sódica (como conservante). Atenção: A azida de sódio é altamente tóxica quando ingerido oralmente ou absorvido pela pele. Concentrado de soluções (em 5% ou maior) devem ser tratadas sob uma coifa de azida de sódio.</li>
</ol>2. Delipidation e permeabilização
Tempo: 1-2 dias
<ol><li>Prepare-se 20%, 40%, 60% e 80% gradiente de metanol com B1n buffer (tabela 1) (v/v), por exemplo, para reserva de 20% de metanol/B1n, misture 20 mL de metanol e 80 mL de tampão de B1n. Armazenar todos os buffers a 4 ° C. Cristais de glicina irão precipitar de buffers de metanol/B1n 60% e 80% devido à saturação. Evite remover os cristais; Use a solução líquida para as lavagens seguintes. Atenção: O metanol é volátil, irritantes e inflamáveis. Evite a pele ou olhos.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o cabelo da amostra sob um microscópio de dissecação. Qualquer cabelo, fiapos ou detritos anexado à amostra causará sombras durante a imagem latente. Transferi a amostra limpa para um tubo novo.</li>
	<li>Execute todas as etapas seguintes no gelo ou a 4 ° C a menos que indicado de outra forma. Para pequenas amostras (por exemplo, posteriores almofadas de gordura subcutânea/perigonadal de jovens ratos magras), utilizar 2 mL microcentrifuga tubos com 1,6 mL da solução. Para amostras grandes ou as amostras com alto teor lipídico (por exemplo, almofadas de gordura de ratos obesos), usar tubos de 5 mL com 4 mL de solução.<ol>
<li>Coloque os tubos contendo as amostras horizontalmente em um agitador orbital de ~ 100 rpm. Certifique-se que as amostras podem circular livremente no interior do tubo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desidrate a amostra em uma série graduada de 20%, 40%, 60%, 80% e 100% metanol/B1n buffer para a hora indicada (tabela 2). Minimize a solução de reporte.</li>
	<li>Delipidate a amostra com o diclorometano (DCM) de 100% (3 vezes), cada um com o tempo de incubação indicado na tabela 2. A amostra deve afundar até o fundo do tubo no final das segunda e terceiros lavagens de DCM. Se não, estender o tempo de incubação para garantir delipidation completo (por exemplo, estender de 30 min a 1-2 h). Cuidado: DCM deve ser tratado dentro de uma coifa. Use recipientes de vidro para armazenamento e microcentrifuga tubos que são feitos de polipropileno para incubação do. Os tubos de microcentrifuga não devem ser utilizados para armazenamento a longo prazo do DCM. Placas de Petri e pipetas que são feitas de poliestireno não são compatíveis com DCM. DCM é altamente volátil. Transferi a amostra para solução fresca rapidamente para evitar a dessecação.</li>
	<li>Lave duas vezes com 100% de metanol para a hora indicada (tabela 2).</li>
	<li>Opcional: Se a amostra não é bem perfundida, a cor da hemoglobina das células vermelhas do sangue restantes pode causar forte autofluorescência. Descorar com 5% H2O2 em metanol (1 volume de 30% H2O2 a 5 volumes de metanol) durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Reidratar a amostra em uma série de amortecedor invertido metanol/B1n: 80%, 60%, 40%, 20% metanol/B1n e 100% B1n tampão (2 vezes) para a hora indicada (tabela 2).</li>
	<li>Lavar a amostra com buffer de PTxwH (tabela 1) para 2 h em RT</li>
	<li>Armazenar a amostra de deslipemizado no buffer de PTxwH a 4° C (até 1 ano) ou proceder de imediato à etapa de imunocoloração.</li>
</ol>3. toda montagem imunocoloração
Tempo: 8-10 dias
Nota: Todas as etapas a seguintes devem ser efectuadas em RT salvo indicação em contrário, com a agitação e a proteção da luz. Para pequenas amostras, use 2 mL microcentrifuge tubos com 1,6 mL de solução. Para amostras grandes, use tubos de 5 mL com 4 mL de solução. Recomenda-se primeiro validar os anticorpos em pequenos pedaços de tecido ou secções de tecido Tratado de metanol.
<ol><li>Dilua o anticorpo primário no buffer de PTxwH, na concentração recomendada. Centrifugue a solução diluída de anticorpo em ~ 20.000 x g durante 10 minutos evitar a introdução de anticorpo precipitados ou agregações.</li>
	<li>Incube a amostra deslipemizado com a solução de anticorpo primário durante o tempo indicado (tabela 2).</li>
	<li>Lavar a amostra com buffer de PTxwH em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1h, 2h, 4h e durante a noite.</li>
	<li>Dilua o anticorpo secundário no buffer de PTxwH, na concentração recomendada. Centrifugue a solução diluída de anticorpo em ~ 20.000 x g durante 10 minutos evitar a introdução de anticorpo precipitados ou agregações. Nota: Para evitar o fundo elevado causado por tecido autofluorescência, anticorpos secundarios conjugados com fluorophores que emitem luz nas regiões do vermelhas e far-red são recomendados. Dependendo do número de linhas de laser disponíveis em um microscópio, até 3-4 marcadores pode ser fotografada simultaneamente em uma amostra.</li>
	<li>Incube a amostra com a solução de anticorpo secundário durante o tempo indicado (tabela 2).</li>
	<li>Amostra de lavagem com buffer de PTxwH em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1h, 2h, 4h e durante a noite.</li>
	<li>Opcional: Para tipos de tecido que são frágeis, fixe o tecido manchado com 4% PFA em 1X PBS durante a noite a 4 ° C, para ajudar a preservar a morfologia do tecido. Nota: Este passo pode aumentar a imagem de fundo. Não é necessário efectuar este passo para o tecido adiposo.</li>
	<li>Lavar a amostra com PBS 1x em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min e 30 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o fiapo da amostra sob um microscópio de dissecação.</li>
</ol>4. tecido clareira
Tempo: 1-2 dias
<ol><li>Opcional: Incorpore a amostra em agarose para facilitar a montagem de amostra para microscopia de luz-folha. Nota: Este passo é fortemente recomendado para tecido adiposo estabilizar sua forma durante a imagem latente.<ol>
<li>Prepare a solução de encastre com agarose a 1% em 1X PBS (p/v). Esfriar a solução incorporação de ~ 40 ° C para evitar a exposição da amostra ao calor excessivo.</li>
		<li>Colocar a amostra limpa em um molde (por exemplo, placa de Petri ou barco de pesagem) e organizá-lo para a posição desejada. Evite qualquer transição líquida. Delicadamente, despeje a solução de incorporação da amostra. Evite quaisquer bolhas de ar.</li>
		<li>Deixe o agarose totalmente solidificar no RT. corte para fora de um bloco que contém a amostra. Nota: Todas as etapas seguintes, incluindo a incubação do durante a noite devem ser efectuadas RT, com agitação e proteção da luz. Para pequenas amostras, use 2 mL microcentrifuge tubos com 1,6 mL de solução. Para amostras grandes, use tubos de 5 mL com 4 mL de solução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desidrate a amostra em gradiente de metanol com H2O: 25%, 50%, 75% e 100% (3 vezes) para a hora indicada (tabela 2). Nota: Amostra pode ser deixada durante a noite no passo metanol 100%.</li>
	<li>Incube a amostra em 100% o DCM para 1 h com agitação (3 vezes). Amostra deve afundar até o fundo do tubo na extremidade de cada lavagem de DCM. Se não, estender o tempo de incubação para assegurar a remoção completa de metanol. Amostra pode ser deixada durante a noite no passo DCM 100%.</li>
	<li>Incube a amostra em éter dibenzyl (DBE) durante a noite com agitação suave para alcançar o índice de refração de correspondência. Nota: Amostra vai eventualmente se tornar transparente à luz visível. Atenção: O DBE é perigosa. Evite qualquer contacto com a pele. Lidar com isso dentro de uma coifa com duas camadas de luvas. Descarte as luvas quando está contaminado com DBE. Use recipientes de vidro para armazenamento e microcentrifuga tubos (polipropileno) para incubação do. Os tubos de microcentrifuga não devem ser utilizados para armazenamento a longo prazo do DBE. Placas de Petri e pipetas que são feitas de poliestireno não são compatíveis com o DBE. Limpe qualquer vazamento com 100% de etanol.</li>
	<li>Incubar a amostra com DBE fresco com leve agitação por 2 h. loja da amostra RT no escuro ou proceder diretamente à imagem. Nota: As amostras são recomendadas para ser fotografada dentro de um mês. Embora certas fluorophores são mais estáveis do que outros, armazenamento a longo prazo das amostras nesta fase não é recomendado.</li>
</ol>5. microscopia
<ol><li>Imagem com um microscópio de luz-folha que é compatível com o DBE. Nota: Apenas os objetivos que são aprovados para geração de imagens baseada em solvente orgânica e combinados com o índice de refração do DBE podem ser usados como mergulhando objectivos em imagiologia DBE-imerso.<ol>
<li>Monte a amostra de agarose-encaixadas em um suporte que pode impedir o movimento durante a imagem latente. Imergir a amostra em uma câmara cheia de DBE.</li>
		<li>Recolha uma z-pilha cobrindo toda a amostra (por exemplo, ampliação de X 1-2) para obter a distribuição de todo tecido/estrutura do marcador de interesse.</li>
		<li>Alternar para um objectivo com maior ampliação (por exemplo, ampliação de 4-12 X) para ampliar as regiões de interesse para estruturas detalhadas da imagem. Nota: O colágeno é dos principais contribuintes para a matriz extracelular do tecido adiposo, que envolve todas as células de gordura13. Colagénio tem um espectro de emissão típico que variam de cerca de 400 nm a 550 nm14. Imagem da amostra com a linha de 488 laser (verde) e recolher a luz emitida em um intervalo de comprimento de onda que se encontra dentro do espectro de emissão de colágeno (por exemplo, 525-550 nm) irão fornecer o sinal de autofluorescência de tecido, que anteriormente foi mostrado para delinear o contorno da célula de gordura e de arquitetura de tecido geral12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geração de imagens com uma invertida confocal ou um microscópio de dois fotões.<ol>
<li>Coloca a amostra de agarose-incorporado em um slide de câmara com um fundo de vidro sem tocar qualquer peças de plástico (ou outra câmara de imagem compatível com o DBE que pode selar). Certifique-se de que DBE não vazar.</li>
		<li>Escolha os objectivos com longas distâncias de trabalho para alcançar penetração mais profunda. Nota: A imagem deve ser feita com um microscópio confocal ou dois fotões invertido através do vidro de fundo do slide câmara. Evite o contato direto entre a amostra e mergulhando objectivos que não são sugeridos para geração de imagens baseada em DBE.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+We+Talk+About+When+We+Talk+About+Fat.">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+innervation+of+white+adipose+tissue+and+the+control+of+lipolysis.">Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).</li><li>Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Neural+Regulation+of+Brown+Adipose+Tissue+Thermogenesis+and+Energy+Expenditure.">Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-Independent+Angiogenesis+in+Adipose+Tissues+during+Cold+Acclimation.">Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li><li>Shimizu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+rarefaction+mediates+whitening+of+brown+fat+in+obesity.">Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).</li><li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+brain+section+images+for+creating+axonal+projection+maps+in+marmosets.">3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets.</a> Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+Simple,+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging.">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis:+Role+of+Collagen+VI.">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li><li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging:+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis.">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li><li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice.">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li><li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans.">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Adipo-Clear é um método simples e robusto para limpar o tecido adiposo, que pode ser facilmente executado em uma configuração de laboratório normal. Em comparação com outros métodos de limpeza à base de solvente como iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear é especialmente otimizado para limpar o tecido adiposo e outros tecidos com alto teor de gordura. A etapa de delipidation remove completamente os lipídios do adiposo...

Até recentemente, tecido adiposo foi concebido como uma coleção amorfa de células de gordura. Ao longo das últimas décadas, nosso entendimento tem crescido mais sofisticado, com gordura agora reconhecida para ser um órgão complexo que contém diferentes tipos de adipócitos, bem como precursores dos adipócitos, células do sistema imunológico, fibroblastos, a vasculatura e projeções de nervo. Interações entre estas células adiposo-residente tem pronunciado efeitos no tecido adiposo e a fisiologia e fisiopatologia1. Embora estudos emergentes têm desvendados importantes mecanismos moleculares subjacentes a certas interações, uma compreensão mais abrangente requer perfil estrutural confiável do tecido inteiro em três dimensões (3D).
Nosso conhecimento atual da morfologia do tecido adiposo é amplamente baseado na análise histológica de seções finas (5 μm), com imagens relativamente alta ampliação (mais de 10 X)2,3. No entanto, esta abordagem tem várias limitações significativas. Primeiras, intricadas estruturas filamentosas como nervos simpáticos e a vascularização, que são conhecidas por desempenhar um papel importante na função do tecido adiposo4,5,6,7, são difíceis de avaliar através de seções finas. Em segundo lugar, devido à sua forma aparentemente amorfa e a falta de unidades estruturais representativas para focar, é difícil apreciar o tecido adiposo estruturas baseadas apenas na coloração de seção. Em terceiro lugar, o tecido adiposo tem um muito alto teor lipídico, criando desafios na obtenção de secções seriais consistentes que são adequadas para a reconstrução anatômica 3D, um método convencional usado para estudar o cérebro inteiro morfologia8. Tendo em conta estes factores, há uma grande necessidade de uma abordagem de conjunto de montagem que pode fornecer a visualização 3D de um depósito de tecido adiposo inteira e ainda alcançar a resolução do celular.
Imagem em 3D volumétrica de um órgão inteiro é um desafio devido aos efeitos obscuring de dispersão de luz. Uma importante fonte de dispersão de luz no tecido biológico vem de interfaces lipid-aquosa. Apesar dos esforços para eliminar a dispersão através da remoção de lipídios foram em curso para mais de um século, tem havido um grande número de recentes inovações9. Um tal método de limpeza de tecidos recém-desenvolvido é uma imagem de 3D habilitado para immunolabeling de órgãos solvente-desmarcada (iDISCO / iDISCO +)10,11. No entanto, o tecido adiposo apresenta um desafio particular, dado o seu alto nível de lipídios e portanto, modificações adicionais para o iDISCO / iDISCO + protocolo são necessário para extrair totalmente os lipídios, protegendo o tecido de entrar em colapso. O protocolo modificado que desenvolvemos, agora chamado Adipo-Clear, emprega baseada em metanol/diclorometano delipidation do tecido adiposo para alcançar a transparência ideal apropriada para imagiologia volumétrica de alta resolução12. Porque o delipidation passo largamente sacia endogenamente expressas proteínas fluorescentes como GFP e RFP, visualização de tais proteínas deve ser alcançada por immunolabeling. Em geral, este protocolo simples e robusto pode ser aplicado para estudar a organização nível de tecido adiposo-residente células, rastreamento de linhagem de células progenitoras de adipócitos e tecido adiposo morfogênese durante o desenvolvimento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>325-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71289-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3628</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1957</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Ultramicroscope II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Imspector software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy visualization software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

Tecido adiposo desempenha um papel central na homeostase de energia e termorregulação. Ele é composto de diferentes tipos de adipócitos, bem como precursores dos adipócitos, células do sistema imunológico, fibroblastos, vasos sanguíneos e projeções de nervo. Embora o controle molecular da especificação do tipo de célula e como interagem estas células foram delineados cada vez mais, uma compreensão mais abrangente destas células adiposo-residente pode ser alcançada através da visualização de sua distribuição e arquitetura em todo o tecido todo. As abordagens existentes de imuno-histoquímica e imunofluorescência para analisar histologia tecido adiposa dependem de seções finas de parafina. No entanto, seções finas captura apenas uma pequena porção de tecido; Como resultado, as conclusões podem ser influenciadas por qual parte do tecido é analisada. Portanto, nós desenvolvemos um tecido adiposo, limpeza técnica, Adipo-Clear, para permitir a completa visualização tridimensional de padrões moleculares e celulares nos tecidos adiposos. Adipo-Clear foi adaptado de iDISCO / iDISCO +, com modificações específicas feitas para remover completamente os lipídios armazenados no tecido, preservando a morfologia do tecido nativo. Em combinação com microscopia de fluorescência de luz-folha, vamos mostrar aqui o uso de Adipo-Clear método para obter imagens de alta resolução volumétricas, de um tecido adiposo inteira.

Adipo-Clear preparado toda gordura almofadas podem ser fotografadas em 3D para analisar como interações de morfologia e celular do tecido são afetadas nos Estados magros e obesos. Esse método pode ser facilmente aplicado para analisar a estrutura geral do tecido adiposa, recolhendo o sinal de autofluorescência de tecido no canal verde. Anteriormente mostramos que a autofluorescência sinal em sobreposições de tecido adiposas favoravelmente com perilipin de coloração, um marcador ...

Watch this Scientific Journal Video about Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue at JoVE.com

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Devido ao alto teor lipídico, o tecido adiposo tem sido desafiador para visualizar usando métodos histológicos de tradicionais. Adipo-Clear é um tecido de limpeza técnica que permite que a rotulagem robusto e alta resolução imagem fluorescente volumétrica do tecido adiposo. Aqui, descrevemos os métodos para a preparação da amostra, pré-tratamento, coloração, limpeza e montagem para a imagem latente.

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

adipo-clear-tissue-clearing-method-for-three-dimensional-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

26.9K visualizações.  The Rockefeller University. Devido ao alto teor lipídico, o tecido adiposo tem sido desafiador para visualizar usando métodos histológicos de tradicionais. Adipo-Clear é um tecido de limpeza técnica que permite que a rotulagem robusto e alta resolução imagem fluorescente volumétrica do tecido adiposo. Aqui, descrevemos os métodos para a preparação da amostra, pré-tratamento, coloração, limpeza e montagem para a imagem latente.

Vídeo: Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologia

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Um sistema para a cultura de células epiteliais pigmentadas da íris para estudo da regeneração Lens em Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging no hidrogéis tridimensionais

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-PRESTO: Clearing tecido biológico e Métodos imunomarcação for Imaging Volume

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

Micro-fragmentação do tecido adiposo humano para a caracterização do Phenotyping e do Secretome da pilha

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo