Agradecemos A facilidade de Citometria Comprehensive Cancer Center analíticas centrais Ohio State University, especificamente Katrina Moore, de assistência técnica com a análise FACS. Além disso, reconhecemos Dr. William Pu e seu grupo por suas descobertas científicas. Este trabalho foi financiado pelo NIH HL091878 (JL) e do Centro do Coração do Hospital Nacional Infantil.

1 Preparação de equipamentos e soluções <ol><li> Esterilizar os instrumentos de dissecação - tesoura de tecido fino para extrair corações adultos e 2 pinça fina para dissecção da região valvular - por autoclavagem em uma bandeja instrumento coberto. Spray de ferramentas com 70% de etanol (EtOH), antes da dissecção. </li><li> Preparar todas as soluções imediatamente antes da experiência e esterilizar soluções fazendo-os passar através de um filtro estéril de 0,2 um. Manter as soluções em gelo até o uso. <ol><li> Tampão de Dissociação estéril (15 ml no total / amostra). Combine 1,2 ml de colagenase IV, 300 mL de 2,5% de tripsina e 150 mL de soro garota. Levar o volume até 15 ml com uma solução salina equilibrada de Hank (HBSS). </li><li> Estéril Sorting Buffer (12 ml total). Combinar 25 mL de 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 12 ul de DNase I (isenta de RNase). Levar o volume até 12 ml com HBSS. </li><li> Cultura VEC Media. Gro endoteliais Mixwth meios de comunicação de acordo com as instruções do fabricante (ver material de folha de cálculo) por adição dos componentes do kit de aliquotas de 500 ml de meio EBM2. </li><li> GFP negativo Meios de Cultura (media de células não-endotelial). Misturar 445 ml de Meio 199 1x com 5 ml de penicilina / estreptomicina (pen / estrep) (1% de concentração final) e 50 ml de FBS (10% concentração final). </li></ol></li></ol> 2. dissecação da região valvular de camundongos adultos e embriões E14.5 <ul><li> Todos os procedimentos com animais foram aprovados e executados de acordo com as diretrizes Hospital Research Institute IACUC do Nationwide Children. </li><li> Camundongos Tie2-GFP foram adquiridos de Jackson Laboratories (número de estoque 003.658) e 14 foram mantidos como genótipos homozigotos em um fundo FVB / N, e, portanto, assegurar que todos os off-primavera GFP expressa em células endoteliais Tie2-positivos. </li><li> Para FACS classificação, preparar uma idade combinada samp negativole que não contém GFP como C57 / Bl6 para definir os parâmetros de porta GFP para FACS classificação. NOTA: Este protocolo e resultados representativos são baseados no uso de três, camundongos adultos de quatro meses de idade, ou uma ninhada no dia embrionário (E) 14,5. </li></ul><ol><li> Ratos adultos: Imediatamente após sacrifício pelo CO 2 anoxia, usar tesouras de dissecação para abrir cuidadosamente a cavidade torácica e expor o coração e os pulmões. Uma vez exposto, o aperto no coração com uma pinça nas grandes artérias e puxe para fora do corpo. Remover o tecido pulmonar se intacto, e colocar o coração no frio HBSS para enxaguar. Retire o ventrículo e afastar os átrios deixando o canal atrioventricular &quot;anel&quot; e regiões da aorta intacta. Faça uma incisão abaixo do lado do canal atrioventricular para abrir o &quot;anel&quot; e expor as estruturas valvulares. Retire a regiões aorta proximal miocárdio e delicadamente provocando afastado com uma pinça. Identificar os folhetos da válvula de tecido branco, denso sobre o miocárdio rosa. Gentilmente DETACH O cordas tendíneas das valvas atrioventriculares e remover o máximo do miocárdio remanescente possível. Tenha cuidado para não puxar ou raspar os folhetos da válvula durante este processo desde VECs pode ser desalojado. Coloque regiões valvulares aparadas num tubo eppendorf de 1,5 ml contendo 1 ml de HBSS e manter em gelo. NOTA: dissecção cuidadosa é fundamental para eliminar as células endoteliais não-valvular que podem contaminar a amostra. </li><li> Embriões: Sacrifício camundongos fêmeas 14,0 dias após a tomada cópula é observado (manhã de cópula ficha = 0,5 dias). <ol><li> Imediatamente após o sacrifício, dissecar o útero (contendo embriões) e lave em água fria HBSS. Dissecar embriões individuais a partir do útero e remover o saco vitelino embrionário em torno de cada embrião. Retire os corações de cada um dos embriões e siga o passo 2.1. (NOTA: apertando suavemente o embrião com uma pinça, logo abaixo dos apêndices superiores devem ajudar a expor o coração e fazer a remoção mais fácil.) </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. A dissociação celular e Preparação para FACS <ol><li> Usando pontas de pipetas estéreis, remover HBSS do tubo eppendorf contendo as regiões valvulares. </li><li> Substituir com 1 ml de tampão de dissociação e 4 mL DNase I. </li><li> Rodar os tubos a 37 ° C durante 7 min. </li><li> Pipeta cima e para baixo três vezes e, em seguida, deixe a amostra se contentar com 15 seg. Recolhe-se o sobrenadante (contendo as células dissociadas) num tubo cónico de 15 ml. </li><li> Para parar a reacção de colagenase, adicionar 125 ul de soro de cavalo para o tubo de recolha. Mantenha tubo de coleta no gelo. </li><li> Etapas de dissociação de repetição (3,2-3,5) nove vezes para coletar nove frações de sobrenadante. </li><li> Passar a recolha fraccionada através de um filtro de nylon de 70 um para um novo tubo de recolha para garantir uma suspensão de células individuais através da remoção de quaisquer detritos e aglomerados. </li><li> Girar a suspensão a 400 g durante 5 min para sedimentar as células. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de Tampão de Triagem emanter em gelo até FACS. </li></ol> 4. FACS Classificando GFP VECs positivo <ol><li> Definir portas para a frente e dispersão lateral para excluir detritos e capturar células individuais; excluir dupletos usando discriminação dupleto gating. Registre a amostra de controlo negativa e definir as configurações da porta, a fim de comparar e definir com precisão a população de células GFP-positivo na amostra Tie2-GFP. </li><li> Analise as células GFP positivas via FACS e refinar as definições de porta. </li><li> Ordenar amostra Tie2-GFP e recolher ambas as células GFP positivas e negativas para GFP. Se as células serão utilizadas para extração de RNA, uma espécie diretamente no Sorting Buffer. Para células de cultura após FACS, recolher as células positivas para GFP em um tubo de ensaio estéril contendo 1 ml de meio com VEC 1 ml de FBS, e recolher as células negativas para GFP em 1 ml de meio não-endoteliais com FBS a 1 ml. Utiliza esta combinação de media / 50% de soro de 50% para melhorar a viabilidade celular. Manter em gelo até a análise pós FACS. </li></ol> 5. Publicar FACS Analysis <ol><li> Extração de RNA: <ol><li> Imediatamente depois de FACS, as células positivas e negativas para GFP centrífuga a 1500 x g durante 8 min. </li><li> Pipetar cuidadosamente o sobrenadante (tampão de triagem) e descarte. </li><li> Ressuspender o pellet celular (pellet não é visível para os tamanhos de amostra recomendados aqui) em 200 mL de Trizol. </li><li> Congelar a -80 ° C, ou começar a extracção com fenol-clorofórmio padrão para isolar mRNA total, como descrito anteriormente pelo nosso laboratório 15. </li><li> Use 50-200 ng de ARN para a síntese do ADNc, utilizando o Mastermix de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Assunto cDNA para amplificação por PCR quantitativa utilizando sondas IDT Primetime qPCR contra marcadores de células endoteliais (CD31 rato, fator de von Willebrand (vWF)), marcadores de válvula de células intersticiais (actina de músculo liso-α (α-SMA), periostin (POSTN)), miócitos marcadores (Mhc6, Mhc7) e GAPDH. </li></ol&gt; </li><li> Cultura Murino VEC: <ol><li> Após FACS triagem e coleta de células (passo 4.3), as células centrifugar a 300 xg por 5 min. </li><li> Pipetar cuidadosamente o sobrenadante (triagem tampão + mídia) e descarte. </li><li> Ressuspender o sedimento de células GFP positivas em 1 ml de meio de VEC e o sedimento de GFP-negativa em 1 ml de meio não endoteliais. </li><li> Placa cada amostra em um poço de um slide câmara de plástico e crescer até à confluência. Cultura durante cerca de 1 semana para as células negativas para GFP tornam-se confluentes e mais do que 2 semanas para as células positivas para GFP para se tornam confluentes (a partir de uma amostra de 3, ratinhos adultos). Mudança de mídia a cada dois dias. </li></ol></li><li> Coloração de imunofluorescência: <ol><li> Retirar a partir de células e meios de fixar em 4% de paraformaldeído (PFA), durante 30 min à TA. Lave as células fixas, três vezes por 5 minutos cada em solução tampão fosfato (PBS). </li><li> Remover poços da câmara de corrediça e no bloco 5% de albumina sérica bovina / 1x PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Incubarcorrediças O / N a 4 ° C com os anticorpos primários (CD31, 1: 1000 ou actina de músculo liso-α (α-SMA), 1: 100). Lavar 3x durante 5 minutos em PBS. </li><li> Dilui-se o anticorpo secundário (Alexa-Fluor 568 anticorpo de cabra anti-rato) de 1: 400 em PBS, adicionar a diapositivos, e incubar 1 hora à temperatura ambiente. Lavar as lâminas 3x durante 5 minutos em PBS. </li><li> Montagem em Vectashield contendo DAPI e incubar 1 h a 4 ° C antes da visualização. </li></ol></li></ol>

<ol>
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K., Gridley, T., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mmp15+is+a+direct+target+of+Snai1+during+endothelial+to+mesenchymal+transformation+and+endocardial+cushion+development.">Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development.</a> Developmental biology. 359, 209-221 (2011).</li><li>Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+environments+from+opposing+sides+of+human+aortic+valve+leaflets+evoke+distinct+endothelial+phenotypes+in+vitro.">Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro.</a> Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).</li><li>Hinton, R. 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E., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+expression+of+collagens+during+murine+atrioventricular+heart+valve+development+and+maintenance.">Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).</li><li>Levay, A. 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Os autores não têm nada a revelar.

Descrevemos aqui pela primeira vez, um novo método para o isolamento de VECs murino embrionários e adultos de ratinhos Tie2-GFP. Embora esta linha de rato tem sido amplamente utilizada para o isolamento de populações de células endoteliais, este é o primeiro relatório mostrando o isolamento selectivo de VECs. Devido à fragilidade da população VEC, temos desenvolvido um protocolo rigoroso, que permite o isolamento de células isoladas de GFP positivo (GFP e negativa) a partir de células de válvulas do coração de ratos embrionários e adultos. Em comparação com a publicação original da utilização de embriões inteiros ou órgãos de Tie2-GFP camundongos 14, temos aperfeiçoado passos colagenase e dissecação com base na baixa abundância desta população de células endoteliais frágil para isolar uma população seleta de células. Isolamentos VEC têm apenas sido previamente relatada em grandes modelos animais com ferramentas genéticas e biomoleculares limitadas. Estas ferramentas são bem estabelecidos em ratos e, portanto, o abilidade para isolar VECs murina permite um conjunto expandido de projetos experimentais para serem utilizadas para a investigação da válvula do coração. Portanto, uma vantagem significativa desta abordagem é que VECs pode ser isolado a partir temporalmente ratinhos de tipo selvagem, e os modelos de doença e lesão da válvula. Uma segunda vantagem é que VECs pode ser isolado e analisado quase imediatamente após a dissecação, preservando padrões de expressão que reflectem a situação in vivo, de forma mais precisa. Além disso, este protocolo de isolamento é suficiente para eliminar a cultura de células para a expansão e, portanto, o número potencial de mudanças fenotípicas induzidas pelo meio ambiente in vitro são impedidos. Apesar das novidades e benefícios experimentais deste protocolo, reconhecemos que ainda existem limitações. Em primeiro lugar, o tamanho da população VEC dentro válvulas de murino é muito pequena e, por conseguinte, várias ninhadas embrionárias temporizados são necessários a fim de gerar ARN suficiente para análise da expressão do gene. Enquanto this pode ser superado usando vários criadores, poderia ter um impacto sobre a aplicação de algumas ferramentas de análise pós-isolamento. Esta limitação tem sido um desafio particular para o estabelecimento de culturas confluentes de VECs GFP positivas, a fim de realizar análises mais aprofundadas dos fenótipos VEC incluindo perfis moleculares e testes funcionais. Portanto, reconhecemos que nem todas as dificuldades foram superadas pela nossa abordagem, mas esta é uma área de interesse que nós estamos nos esforçando para superar. Esta abordagem de isolar VECs de regiões valvulares introduz a possibilidade de contaminação de Tie-GFP células endoteliais -positivas, não-valvular do endocárdio, ou estruturas vasculares dentro do miocárdio ventricular. Até à data, a distinção molecular de VECs de outras populações de células endoteliais cardíacas não foram identificados. No entanto, uma região enhancer do gene NFATc1 foi identificado e mostrado para marcar especificamente VECs que não fazemsubmeter EMT, e nenhuma outra população de células endoteliais dentro do coração 18. Como um modelo de Cre (NFATc1 Encre) está disponível, estudos futuros poderiam utilizar a especificidade desta linha para minimizar os riscos de contaminação. Além de células positivas Tie2-GFP não-valvulares, há sempre a possibilidade de contaminação a partir de miócitos no ponto em que os folhetos da válvula se ligam à região anular do septo e paredes do miocárdio murais. Em dados não mostrados aqui, que inicialmente começou estudos para isolar VECs de regiões valvulares dissecadas usando pérolas de anticorpos conjugados revestidas com anti-GFP e anti-CD31. Embora esta abordagem foi bem sucedida para isolar as células endoteliais, tivemos aglutinação celular significativa de tipos de células adjacentes, não endoteliais e, portanto, VICs e células miocárdicas contaminada nossa amostra experimental. Este tem sido evitada por meio de análise FACS como parâmetros foram estabelecidos para isolar apenas suspensão única células e análise de PCR para detectar a expressão de genes específicos de miócitos foi controlada para esta limitação (Figura 3). Enquanto a nossa contaminação pode ser considerada como o mínimo, ele continua a ser uma complexidade experimental potencial que poderia ser evitado no futuro, com o duplo seleção de GFP e marcadores endoteliais de superfície específica de células. Usando este protocolo, que tem êxito VECs isoladas a partir de ratinhos adultos e embrionários e deram exemplos de como esta abordagem pode ser utilizada para o isolamento de RNA e de cultura de células de populações de células positivas e negativas para GFP GFP. No entanto, esta abordagem não é limitado a estas aplicações e pode ser usado para uma variedade de abordagens moleculares, celulares e funcionais. Além disso, o fundo Tie2-GFP podem ser criados com modelos genéticos do rato que permitam estudos comparativos das populações VEC na saúde e na doença. O desenvolvimento desta nova metodologia irá, pela primeira vez, permitir estudos focalizadosexaminar a contribuição de VECs no desenvolvimento de válvulas e manutenção e pode revelar mecanismos anteriormente desvalorizado doença valvar endotélio-dependente.

A válvula maduro é composto por três camadas estratificadas de matriz extracelular especializada (ECM) intercaladas com células intersticiais de válvula (VICs) e encapsulada por uma única camada de células endoteliais da válvula cardíaca (VECs) 1. O papel do MEC é oferecer todas as propriedades biomecânicas necessárias para resistir a mudanças constantes em vigor hemodinâmica durante o ciclo cardíaco. Volume de negócios da ECM válvula na válvula de adultos é fortemente regulada por VICs que são em grande parte de repouso e de fibroblastos-like, na ausência de doença. Além da população VIC, células endoteliais do coração de válvula (VECs) formar um endotélio ininterrupta sobre a superfície das cúspides da válvula 2. Embora a importância de ECM e VICs para a estrutura e função da válvula ter sido descrito por nós e outros, o papel de VECs é menos bem conhecido. No entanto, esta população de células relativamente pequeno é crítico para a formação da válvula e em que o embrião é descrita como disfuncional na válvuladoença. Formação da válvula do coração no embrião começa quando um subconjunto de células endoteliais nas regiões do canal e do fluxo de saída atrioventricular sofrer endotelial à transformação mesenquimal (EMT) e inchaços forma conhecida como almofadas endocárdio 1,3. As células mesenquimais recém-transformadas dentro destas estruturas depois diferenciar em VICs e formar as válvulas maduros. Uma vez EMT é completa, as células endoteliais que rodeiam as almofadas, denominado VECs, formar uma camada contínua de células endoteliais, que protege a válvula madura contra lesões. Além disso, VECs sentir o ambiente hemodinâmico e demonstraram molecularmente comunicar com VICs subjacentes para regular homeostase 1,3 ECM. Em válvulas doentes, a monocamada VEC é interrompido em associação com alterações anormais na organização ECM e biomecânica alterados 4,5. Além disso, estudos em modelos de ratos sugerem que a disfunção VEC é a causa subjacente da válvula disease 1,6-9. Como VECs desempenhar um papel importante no desenvolvimento da válvula, manutenção e doença, é importante que se defina totalmente seus fenótipos temporais, a fim de avançar no campo e compreender os mecanismos da doença. Os trabalhos anteriores por vários laboratórios isolou com sucesso VECs de suínos e ovinos modelos 10-12. Devido ao grande tamanho destas válvulas, isolamentos através raspagem e / ou digestão enzimática, seguido de um número de diferentes métodos de isolamento, incluindo a separação de células do grânulo magnético e a expansão clonal de uma única célula tem sido eficaz para gerar populações puras 11-13. No entanto, estes modelos podem ser restritivas devido à anotação incompleta dos suínos e ovinos genomas limitam a disponibilidade de ferramentas moleculares para além dos elevados custos. Portanto experimentação de suínos e ovinos VECs após o isolamento pode ser restritiva. Modelos de mouse são preferíveis devido às muitas possibilidades de manipulações genéticasção e ferramentas moleculares no embrião e no adulto, mas até à data, não houve isolamentos VEC em pequenos modelos animais têm sido relatados. Isto é provavelmente devido à dificuldade de trabalhar com pequenas amostras de tecido que inclui uma população de células que carecem actualmente minoria identidade única de marcadores específicos VEC-, impedindo assim a métodos de isolamento à base de anticorpos. Neste artigo, apresentamos um novo método para o isolamento direto do VECs murino em fases embrionárias e adultas. Este protocolo aproveita camundongos Tie2-GFP, que expressam GFP em todos os tipos de células endoteliais e têm sido amplamente utilizados para estudar as populações de células endoteliais 14. No entanto, a novidade do presente estudo é o de que estes ratinhos, pela primeira vez, foram utilizados para isolar as células endoteliais a partir das válvulas. Por dissecção cuidadosa do tecido da válvula e um conjunto de nove digestões enzimáticas, seguida pela separação por FACS, VECs podem ser isolados e utilizados para várias técnicas experimentaiscluindo extração de RNA e da cultura, diretamente após a classificação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>		
<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">A-11077</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:107px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:107px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">2.5% Trypsin</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:107px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:107px;">553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Chick Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16110-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">17104-019</td>
			<td>Prepared according to manufactuer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DNase I, RNase free (10,000 Units)</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:107px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC3156</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">EDTA, 0.5M Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Hoefer</td>
			<td style="width:107px;">03-500-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">EGM2 SingleQuot, Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC-4176</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td style="width:107px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH3007103IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">230301V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Medium 199 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Paraformaldehyde 16% Solution EM grade</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:107px;">MP-Biomed</td>
			<td style="width:107px;">ICN1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Permanox sterile chamber slide with cover</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:107px;">177429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">PrimeTime Mini qPCR Assay</td>
			<td style="width:107px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:107px;">Acta2 (&#945;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:107px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:107px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">SuperScript VILO Mastermix</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tie2-GFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">3658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tissue forceps #5 11cm</td>
			<td style="width:107px;">Dumont</td>
			<td style="width:107px;">14096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Trizol</td>
			<td style="width:107px;">Ambion</td>
			<td style="width:107px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">&#945;-SMA anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:107px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine valve endothelial cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

Células Tie2-GFP co-localizar com marcadores de células endoteliais nas válvulas cardíacas embrionárias e adultas. De modo a confirmar a especificidade de expressão da GFP em Tie2-VECs de ratos embrionários e adultos, a imunofluorescência foi realizada para determinar a co-localização com o marcador celular endotelial, CD31, em secções de tecidos preparados a partir de E14.5 e 3 meses de idade adulta Tie2-GFP camundongos, usando métodos publicado anteriormente pelo nosso laboratório 16. Como mostrado na Figura 1, VECs co-express de GFP (Figura 1 A, B, E, F) e CD31 (Figura 1 C, D, E, F), tanto adulto (Figura 1 B, D, F) e embrionário ( Figura 1 A, C, E) fases, por conseguinte, validar o nosso modelo para a subsequente isolamento VEC. Análise FACS identificaram as populações de células GFP positivas e negativas para GFP em diferentes válvulas cardíacas embrionárias e adultas isoladas a partir de ratinhos de Tie2-GFP. Selvagem tipo ratinhos C57 / Bl6 foram utilizados para definir os parâmetros de GFP e cerca de 2% de células isoladas a partir de ratinhos-gated Tie2-GFP mostram um enriquecimento significativo em células GFP positivas por análise FACS em ambas as amostras embrionários e adultos (Figura 2). Com base em estudos de co-localização mostrados na Figura 1, estas células são consideradas VECs e produzir uma média de 61.800 células totais (amostras variam de 39,000-77,000 células / amostra) em amostras de adultos (n = 3), e 8928 células (8,015- 11.000 células / litro) de uma ninhada de embriões E14.5. Análise de PCR confirma enriquecimento de marcadores de células endoteliais em células GFP positivas e válvulas marcadores de células intersticiais em células GFP-negativos isolados de camundongos Tie2-GFP. Gene análise da GFP populações positivas e negativas celulares por qPCR seguintes FACS expressão mostram perfis moleculares distintos. Em comparação com populações de células de GFP isolado a partir de embriões negativo Tie2-GFP e adults, as células positivas para GFP são enriquecidas para a expressão de marcadores de células endoteliais CD31 e vWF, (Figura 3). Além disso, a expressão de marcadores de miócitos (Myh6, MYH7) nestas populações de células é muito baixo, demonstrando a contaminação mínima das células não endoteliais. Em contraste, as células GFP negativos isolados de camundongos adultos Tie2-GFP e embriões E14.5 são enriquecidos para válvula célula intersticial (VIC), marcadores de células positivas α-SMA e periostin (POSTN) em relação ao GFP. Enriquecimento destes marcadores é superior em células negativas para GFP isolado a partir de amostras de E14.5 comparados com os adultos devido ao fenótipo quiescente da VICs adultos e, por conseguinte, de baixa expressão de marcadores activados. Células GFP positivas isoladas a partir de ratinhos adultos Tie2-GFP podem ser cultivadas in vitro. A capacidade de cultura de células GFP positivas e negativas GFP isoladas de amostras de adultos foi examinado de based na morfologia celular e coloração imuno-histoquímica. Usando protocolos anteriormente descritos por nós 17 que mostram na Figura 4, que as células GFP positivas aparecem rodada em morfologia (Figura 4A) e co-express de GFP com o marcador celular endotelial CD31 após duas semanas de cultura (Figura 4C). Em contraste, as células endoteliais não são negativas para GFP, exibe uma morfologia mesenquimal semelhante (Figura 4B) e expressam o marcador VIC α-SMA, após nove dias (Figura 4D). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1. células Tie2-GFP-positivas com a co-localizar CD31 em válvulas cardíacas embrionários e adultos. Imunofluorescência para mostrar associação de (Tie2-) expressão da GFP (A, B) com o marcador celular endotelial, CD31 (C, D) em os sfolhetos eptal da válvula mitral em E14.5 (A, C, E) e adulto (B, D, F) etapas. A região da válvula é destaque na A, C, E. (E, F) imagens fundidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. VECs Tie2-GFP-positivas pode ser identificada por FACS. Comparado com os controlos C57 / Bl6 pareados por idade (A, C), as válvulas isoladas a partir de embriões de Tie2-GFP (B) e adultos (D) conter um GFP distinta população de células positivas, como indicado em verde. Eventos GFP-negativo, mostrado em vermelho foram recolhidos como um controlo. Os números em (B) e (D) indicam a média% de GFP-pcélulas ositive do número total de eventos ordenados por FACS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. células GFP positivas são enriquecidos para os marcadores de células endoteliais enquanto que as células de GFP-negativas expressam genes associados com as células intersticiais de válvula. Representativas qPCR de marcadores de células endoteliais (CD31, Factor de von Willebrand (vWF)) e adultos (Myh6) e fetal ( MYH7) marcadores de miócitos nas células GFP positivas isoladas de regiões valvulares do E14.5 (A) e de adulto (B) ratinhos Tie2-GFP. Nota enriquecimento de marcadores de células endoteliais e níveis muito baixos de genes associados a miócitos. (C, D) Fold chaNGES na expressão de marcadores de células intersticiais de válvulas α-SMA e POSTN em células GFP-negativas isoladas de E14.5 (C) e adulto (D) ratos Tie2-GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. células Tie2-GFP positivas manter a expressão de marcadores de células endoteliais in vitro. Seguindo FACS, GFP positivas (A, C) e negativo (B, D) de populações de células de ratos adultos foram cultivadas até à confluência e sujeitas a eliminação progressiva de imagem contraste (A, B) e imunocoloração fluorescente (C, D). Células GFP positivas expressam CD31 (vermelho) (C) depois10 dias de cultura. Em contraste, a expressão da GFP não foi detectada na população de células negativa, que corado positivo para α-SMA, um marcador de VICs activados (D).

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Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

isolation-of-murine-valve-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K visualizações.  The Ohio State University. The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.