Agradecemos A facilidade de Citometria Comprehensive Cancer Center analíticas centrais Ohio State University, especificamente Katrina Moore, de assistência técnica com a análise FACS. Além disso, reconhecemos Dr. William Pu e seu grupo por suas descobertas científicas. Este trabalho foi financiado pelo NIH HL091878 (JL) e do Centro do Coração do Hospital Nacional Infantil.

1 Preparação de equipamentos e soluções <ol><li> Esterilizar os instrumentos de dissecação - tesoura de tecido fino para extrair corações adultos e 2 pinça fina para dissecção da região valvular - por autoclavagem em uma bandeja instrumento coberto. Spray de ferramentas com 70% de etanol (EtOH), antes da dissecção. </li><li> Preparar todas as soluções imediatamente antes da experiência e esterilizar soluções fazendo-os passar através de um filtro estéril de 0,2 um. Manter as soluções em gelo até o uso. <ol><li> Tampão de Dissociação estéril (15 ml no total / amostra). Combine 1,2 ml de colagenase IV, 300 mL de 2,5% de tripsina e 150 mL de soro garota. Levar o volume até 15 ml com uma solução salina equilibrada de Hank (HBSS). </li><li> Estéril Sorting Buffer (12 ml total). Combinar 25 mL de 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 12 ul de DNase I (isenta de RNase). Levar o volume até 12 ml com HBSS. </li><li> Cultura VEC Media. Gro endoteliais Mixwth meios de comunicação de acordo com as instruções do fabricante (ver material de folha de cálculo) por adição dos componentes do kit de aliquotas de 500 ml de meio EBM2. </li><li> GFP negativo Meios de Cultura (media de células não-endotelial). Misturar 445 ml de Meio 199 1x com 5 ml de penicilina / estreptomicina (pen / estrep) (1% de concentração final) e 50 ml de FBS (10% concentração final). </li></ol></li></ol> 2. dissecação da região valvular de camundongos adultos e embriões E14.5 <ul><li> Todos os procedimentos com animais foram aprovados e executados de acordo com as diretrizes Hospital Research Institute IACUC do Nationwide Children. </li><li> Camundongos Tie2-GFP foram adquiridos de Jackson Laboratories (número de estoque 003.658) e 14 foram mantidos como genótipos homozigotos em um fundo FVB / N, e, portanto, assegurar que todos os off-primavera GFP expressa em células endoteliais Tie2-positivos. </li><li> Para FACS classificação, preparar uma idade combinada samp negativole que não contém GFP como C57 / Bl6 para definir os parâmetros de porta GFP para FACS classificação. NOTA: Este protocolo e resultados representativos são baseados no uso de três, camundongos adultos de quatro meses de idade, ou uma ninhada no dia embrionário (E) 14,5. </li></ul><ol><li> Ratos adultos: Imediatamente após sacrifício pelo CO 2 anoxia, usar tesouras de dissecação para abrir cuidadosamente a cavidade torácica e expor o coração e os pulmões. Uma vez exposto, o aperto no coração com uma pinça nas grandes artérias e puxe para fora do corpo. Remover o tecido pulmonar se intacto, e colocar o coração no frio HBSS para enxaguar. Retire o ventrículo e afastar os átrios deixando o canal atrioventricular &quot;anel&quot; e regiões da aorta intacta. Faça uma incisão abaixo do lado do canal atrioventricular para abrir o &quot;anel&quot; e expor as estruturas valvulares. Retire a regiões aorta proximal miocárdio e delicadamente provocando afastado com uma pinça. Identificar os folhetos da válvula de tecido branco, denso sobre o miocárdio rosa. Gentilmente DETACH O cordas tendíneas das valvas atrioventriculares e remover o máximo do miocárdio remanescente possível. Tenha cuidado para não puxar ou raspar os folhetos da válvula durante este processo desde VECs pode ser desalojado. Coloque regiões valvulares aparadas num tubo eppendorf de 1,5 ml contendo 1 ml de HBSS e manter em gelo. NOTA: dissecção cuidadosa é fundamental para eliminar as células endoteliais não-valvular que podem contaminar a amostra. </li><li> Embriões: Sacrifício camundongos fêmeas 14,0 dias após a tomada cópula é observado (manhã de cópula ficha = 0,5 dias). <ol><li> Imediatamente após o sacrifício, dissecar o útero (contendo embriões) e lave em água fria HBSS. Dissecar embriões individuais a partir do útero e remover o saco vitelino embrionário em torno de cada embrião. Retire os corações de cada um dos embriões e siga o passo 2.1. (NOTA: apertando suavemente o embrião com uma pinça, logo abaixo dos apêndices superiores devem ajudar a expor o coração e fazer a remoção mais fácil.) </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. A dissociação celular e Preparação para FACS <ol><li> Usando pontas de pipetas estéreis, remover HBSS do tubo eppendorf contendo as regiões valvulares. </li><li> Substituir com 1 ml de tampão de dissociação e 4 mL DNase I. </li><li> Rodar os tubos a 37 ° C durante 7 min. </li><li> Pipeta cima e para baixo três vezes e, em seguida, deixe a amostra se contentar com 15 seg. Recolhe-se o sobrenadante (contendo as células dissociadas) num tubo cónico de 15 ml. </li><li> Para parar a reacção de colagenase, adicionar 125 ul de soro de cavalo para o tubo de recolha. Mantenha tubo de coleta no gelo. </li><li> Etapas de dissociação de repetição (3,2-3,5) nove vezes para coletar nove frações de sobrenadante. </li><li> Passar a recolha fraccionada através de um filtro de nylon de 70 um para um novo tubo de recolha para garantir uma suspensão de células individuais através da remoção de quaisquer detritos e aglomerados. </li><li> Girar a suspensão a 400 g durante 5 min para sedimentar as células. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de Tampão de Triagem emanter em gelo até FACS. </li></ol> 4. FACS Classificando GFP VECs positivo <ol><li> Definir portas para a frente e dispersão lateral para excluir detritos e capturar células individuais; excluir dupletos usando discriminação dupleto gating. Registre a amostra de controlo negativa e definir as configurações da porta, a fim de comparar e definir com precisão a população de células GFP-positivo na amostra Tie2-GFP. </li><li> Analise as células GFP positivas via FACS e refinar as definições de porta. </li><li> Ordenar amostra Tie2-GFP e recolher ambas as células GFP positivas e negativas para GFP. Se as células serão utilizadas para extração de RNA, uma espécie diretamente no Sorting Buffer. Para células de cultura após FACS, recolher as células positivas para GFP em um tubo de ensaio estéril contendo 1 ml de meio com VEC 1 ml de FBS, e recolher as células negativas para GFP em 1 ml de meio não-endoteliais com FBS a 1 ml. Utiliza esta combinação de media / 50% de soro de 50% para melhorar a viabilidade celular. Manter em gelo até a análise pós FACS. </li></ol> 5. Publicar FACS Analysis <ol><li> Extração de RNA: <ol><li> Imediatamente depois de FACS, as células positivas e negativas para GFP centrífuga a 1500 x g durante 8 min. </li><li> Pipetar cuidadosamente o sobrenadante (tampão de triagem) e descarte. </li><li> Ressuspender o pellet celular (pellet não é visível para os tamanhos de amostra recomendados aqui) em 200 mL de Trizol. </li><li> Congelar a -80 ° C, ou começar a extracção com fenol-clorofórmio padrão para isolar mRNA total, como descrito anteriormente pelo nosso laboratório 15. </li><li> Use 50-200 ng de ARN para a síntese do ADNc, utilizando o Mastermix de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Assunto cDNA para amplificação por PCR quantitativa utilizando sondas IDT Primetime qPCR contra marcadores de células endoteliais (CD31 rato, fator de von Willebrand (vWF)), marcadores de válvula de células intersticiais (actina de músculo liso-α (α-SMA), periostin (POSTN)), miócitos marcadores (Mhc6, Mhc7) e GAPDH. </li></ol&gt; </li><li> Cultura Murino VEC: <ol><li> Após FACS triagem e coleta de células (passo 4.3), as células centrifugar a 300 xg por 5 min. </li><li> Pipetar cuidadosamente o sobrenadante (triagem tampão + mídia) e descarte. </li><li> Ressuspender o sedimento de células GFP positivas em 1 ml de meio de VEC e o sedimento de GFP-negativa em 1 ml de meio não endoteliais. </li><li> Placa cada amostra em um poço de um slide câmara de plástico e crescer até à confluência. Cultura durante cerca de 1 semana para as células negativas para GFP tornam-se confluentes e mais do que 2 semanas para as células positivas para GFP para se tornam confluentes (a partir de uma amostra de 3, ratinhos adultos). Mudança de mídia a cada dois dias. </li></ol></li><li> Coloração de imunofluorescência: <ol><li> Retirar a partir de células e meios de fixar em 4% de paraformaldeído (PFA), durante 30 min à TA. Lave as células fixas, três vezes por 5 minutos cada em solução tampão fosfato (PBS). </li><li> Remover poços da câmara de corrediça e no bloco 5% de albumina sérica bovina / 1x PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Incubarcorrediças O / N a 4 ° C com os anticorpos primários (CD31, 1: 1000 ou actina de músculo liso-α (α-SMA), 1: 100). Lavar 3x durante 5 minutos em PBS. </li><li> Dilui-se o anticorpo secundário (Alexa-Fluor 568 anticorpo de cabra anti-rato) de 1: 400 em PBS, adicionar a diapositivos, e incubar 1 hora à temperatura ambiente. Lavar as lâminas 3x durante 5 minutos em PBS. </li><li> Montagem em Vectashield contendo DAPI e incubar 1 h a 4 ° C antes da visualização. </li></ol></li></ol>

<ol>
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K., Gridley, T., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mmp15+is+a+direct+target+of+Snai1+during+endothelial+to+mesenchymal+transformation+and+endocardial+cushion+development.">Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development.</a> Developmental biology. 359, 209-221 (2011).</li><li>Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+environments+from+opposing+sides+of+human+aortic+valve+leaflets+evoke+distinct+endothelial+phenotypes+in+vitro.">Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro.</a> Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).</li><li>Hinton, R. 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E., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+expression+of+collagens+during+murine+atrioventricular+heart+valve+development+and+maintenance.">Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).</li><li>Levay, A. 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Os autores não têm nada a revelar.

Descrevemos aqui pela primeira vez, um novo método para o isolamento de VECs murino embrionários e adultos de ratinhos Tie2-GFP. Embora esta linha de rato tem sido amplamente utilizada para o isolamento de populações de células endoteliais, este é o primeiro relatório mostrando o isolamento selectivo de VECs. Devido à fragilidade da população VEC, temos desenvolvido um protocolo rigoroso, que permite o isolamento de células isoladas de GFP positivo (GFP e negativa) a partir de células de válvulas do coração de ratos embrionários e adultos. Em comparação com a publicação original da utilização de embriões inteiros ou órgãos de Tie2-GFP camundongos 14, temos aperfeiçoado passos colagenase e dissecação com base na baixa abundância desta população de células endoteliais frágil para isolar uma população seleta de células. Isolamentos VEC têm apenas sido previamente relatada em grandes modelos animais com ferramentas genéticas e biomoleculares limitadas. Estas ferramentas são bem estabelecidos em ratos e, portanto, o abilidade para isolar VECs murina permite um conjunto expandido de projetos experimentais para serem utilizadas para a investigação da válvula do coração. Portanto, uma vantagem significativa desta abordagem é que VECs pode ser isolado a partir temporalmente ratinhos de tipo selvagem, e os modelos de doença e lesão da válvula. Uma segunda vantagem é que VECs pode ser isolado e analisado quase imediatamente após a dissecação, preservando padrões de expressão que reflectem a situação in vivo, de forma mais precisa. Além disso, este protocolo de isolamento é suficiente para eliminar a cultura de células para a expansão e, portanto, o número potencial de mudanças fenotípicas induzidas pelo meio ambiente in vitro são impedidos. Apesar das novidades e benefícios experimentais deste protocolo, reconhecemos que ainda existem limitações. Em primeiro lugar, o tamanho da população VEC dentro válvulas de murino é muito pequena e, por conseguinte, várias ninhadas embrionárias temporizados são necessários a fim de gerar ARN suficiente para análise da expressão do gene. Enquanto this pode ser superado usando vários criadores, poderia ter um impacto sobre a aplicação de algumas ferramentas de análise pós-isolamento. Esta limitação tem sido um desafio particular para o estabelecimento de culturas confluentes de VECs GFP positivas, a fim de realizar análises mais aprofundadas dos fenótipos VEC incluindo perfis moleculares e testes funcionais. Portanto, reconhecemos que nem todas as dificuldades foram superadas pela nossa abordagem, mas esta é uma área de interesse que nós estamos nos esforçando para superar. Esta abordagem de isolar VECs de regiões valvulares introduz a possibilidade de contaminação de Tie-GFP células endoteliais -positivas, não-valvular do endocárdio, ou estruturas vasculares dentro do miocárdio ventricular. Até à data, a distinção molecular de VECs de outras populações de células endoteliais cardíacas não foram identificados. No entanto, uma região enhancer do gene NFATc1 foi identificado e mostrado para marcar especificamente VECs que não fazemsubmeter EMT, e nenhuma outra população de células endoteliais dentro do coração 18. Como um modelo de Cre (NFATc1 Encre) está disponível, estudos futuros poderiam utilizar a especificidade desta linha para minimizar os riscos de contaminação. Além de células positivas Tie2-GFP não-valvulares, há sempre a possibilidade de contaminação a partir de miócitos no ponto em que os folhetos da válvula se ligam à região anular do septo e paredes do miocárdio murais. Em dados não mostrados aqui, que inicialmente começou estudos para isolar VECs de regiões valvulares dissecadas usando pérolas de anticorpos conjugados revestidas com anti-GFP e anti-CD31. Embora esta abordagem foi bem sucedida para isolar as células endoteliais, tivemos aglutinação celular significativa de tipos de células adjacentes, não endoteliais e, portanto, VICs e células miocárdicas contaminada nossa amostra experimental. Este tem sido evitada por meio de análise FACS como parâmetros foram estabelecidos para isolar apenas suspensão única células e análise de PCR para detectar a expressão de genes específicos de miócitos foi controlada para esta limitação (Figura 3). Enquanto a nossa contaminação pode ser considerada como o mínimo, ele continua a ser uma complexidade experimental potencial que poderia ser evitado no futuro, com o duplo seleção de GFP e marcadores endoteliais de superfície específica de células. Usando este protocolo, que tem êxito VECs isoladas a partir de ratinhos adultos e embrionários e deram exemplos de como esta abordagem pode ser utilizada para o isolamento de RNA e de cultura de células de populações de células positivas e negativas para GFP GFP. No entanto, esta abordagem não é limitado a estas aplicações e pode ser usado para uma variedade de abordagens moleculares, celulares e funcionais. Além disso, o fundo Tie2-GFP podem ser criados com modelos genéticos do rato que permitam estudos comparativos das populações VEC na saúde e na doença. O desenvolvimento desta nova metodologia irá, pela primeira vez, permitir estudos focalizadosexaminar a contribuição de VECs no desenvolvimento de válvulas e manutenção e pode revelar mecanismos anteriormente desvalorizado doença valvar endotélio-dependente.

A válvula maduro é composto por três camadas estratificadas de matriz extracelular especializada (ECM) intercaladas com células intersticiais de válvula (VICs) e encapsulada por uma única camada de células endoteliais da válvula cardíaca (VECs) 1. O papel do MEC é oferecer todas as propriedades biomecânicas necessárias para resistir a mudanças constantes em vigor hemodinâmica durante o ciclo cardíaco. Volume de negócios da ECM válvula na válvula de adultos é fortemente regulada por VICs que são em grande parte de repouso e de fibroblastos-like, na ausência de doença. Além da população VIC, células endoteliais do coração de válvula (VECs) formar um endotélio ininterrupta sobre a superfície das cúspides da válvula 2. Embora a importância de ECM e VICs para a estrutura e função da válvula ter sido descrito por nós e outros, o papel de VECs é menos bem conhecido. No entanto, esta população de células relativamente pequeno é crítico para a formação da válvula e em que o embrião é descrita como disfuncional na válvuladoença. Formação da válvula do coração no embrião começa quando um subconjunto de células endoteliais nas regiões do canal e do fluxo de saída atrioventricular sofrer endotelial à transformação mesenquimal (EMT) e inchaços forma conhecida como almofadas endocárdio 1,3. As células mesenquimais recém-transformadas dentro destas estruturas depois diferenciar em VICs e formar as válvulas maduros. Uma vez EMT é completa, as células endoteliais que rodeiam as almofadas, denominado VECs, formar uma camada contínua de células endoteliais, que protege a válvula madura contra lesões. Além disso, VECs sentir o ambiente hemodinâmico e demonstraram molecularmente comunicar com VICs subjacentes para regular homeostase 1,3 ECM. Em válvulas doentes, a monocamada VEC é interrompido em associação com alterações anormais na organização ECM e biomecânica alterados 4,5. Além disso, estudos em modelos de ratos sugerem que a disfunção VEC é a causa subjacente da válvula disease 1,6-9. Como VECs desempenhar um papel importante no desenvolvimento da válvula, manutenção e doença, é importante que se defina totalmente seus fenótipos temporais, a fim de avançar no campo e compreender os mecanismos da doença. Os trabalhos anteriores por vários laboratórios isolou com sucesso VECs de suínos e ovinos modelos 10-12. Devido ao grande tamanho destas válvulas, isolamentos através raspagem e / ou digestão enzimática, seguido de um número de diferentes métodos de isolamento, incluindo a separação de células do grânulo magnético e a expansão clonal de uma única célula tem sido eficaz para gerar populações puras 11-13. No entanto, estes modelos podem ser restritivas devido à anotação incompleta dos suínos e ovinos genomas limitam a disponibilidade de ferramentas moleculares para além dos elevados custos. Portanto experimentação de suínos e ovinos VECs após o isolamento pode ser restritiva. Modelos de mouse são preferíveis devido às muitas possibilidades de manipulações genéticasção e ferramentas moleculares no embrião e no adulto, mas até à data, não houve isolamentos VEC em pequenos modelos animais têm sido relatados. Isto é provavelmente devido à dificuldade de trabalhar com pequenas amostras de tecido que inclui uma população de células que carecem actualmente minoria identidade única de marcadores específicos VEC-, impedindo assim a métodos de isolamento à base de anticorpos. Neste artigo, apresentamos um novo método para o isolamento direto do VECs murino em fases embrionárias e adultas. Este protocolo aproveita camundongos Tie2-GFP, que expressam GFP em todos os tipos de células endoteliais e têm sido amplamente utilizados para estudar as populações de células endoteliais 14. No entanto, a novidade do presente estudo é o de que estes ratinhos, pela primeira vez, foram utilizados para isolar as células endoteliais a partir das válvulas. Por dissecção cuidadosa do tecido da válvula e um conjunto de nove digestões enzimáticas, seguida pela separação por FACS, VECs podem ser isolados e utilizados para várias técnicas experimentaiscluindo extração de RNA e da cultura, diretamente após a classificação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>		
<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">A-11077</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:107px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:107px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">2.5% Trypsin</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:107px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:107px;">553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Chick Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16110-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">17104-019</td>
			<td>Prepared according to manufactuer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DNase I, RNase free (10,000 Units)</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:107px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC3156</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">EDTA, 0.5M Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Hoefer</td>
			<td style="width:107px;">03-500-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">EGM2 SingleQuot, Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC-4176</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td style="width:107px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH3007103IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">230301V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Medium 199 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Paraformaldehyde 16% Solution EM grade</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:107px;">MP-Biomed</td>
			<td style="width:107px;">ICN1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Permanox sterile chamber slide with cover</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:107px;">177429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">PrimeTime Mini qPCR Assay</td>
			<td style="width:107px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:107px;">Acta2 (&#945;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:107px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:107px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">SuperScript VILO Mastermix</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tie2-GFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">3658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tissue forceps #5 11cm</td>
			<td style="width:107px;">Dumont</td>
			<td style="width:107px;">14096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Trizol</td>
			<td style="width:107px;">Ambion</td>
			<td style="width:107px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">&#945;-SMA anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:107px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine valve endothelial cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

Células Tie2-GFP co-localizar com marcadores de células endoteliais nas válvulas cardíacas embrionárias e adultas. De modo a confirmar a especificidade de expressão da GFP em Tie2-VECs de ratos embrionários e adultos, a imunofluorescência foi realizada para determinar a co-localização com o marcador celular endotelial, CD31, em secções de tecidos preparados a partir de E14.5 e 3 meses de idade adulta Tie2-GFP camundongos, usando métodos publicado anteriormente pelo nosso laboratório 16. Como mostrado na Figura 1, VECs co-express de GFP (Figura 1 A, B, E, F) e CD31 (Figura 1 C, D, E, F), tanto adulto (Figura 1 B, D, F) e embrionário ( Figura 1 A, C, E) fases, por conseguinte, validar o nosso modelo para a subsequente isolamento VEC. Análise FACS identificaram as populações de células GFP positivas e negativas para GFP em diferentes válvulas cardíacas embrionárias e adultas isoladas a partir de ratinhos de Tie2-GFP. Selvagem tipo ratinhos C57 / Bl6 foram utilizados para definir os parâmetros de GFP e cerca de 2% de células isoladas a partir de ratinhos-gated Tie2-GFP mostram um enriquecimento significativo em células GFP positivas por análise FACS em ambas as amostras embrionários e adultos (Figura 2). Com base em estudos de co-localização mostrados na Figura 1, estas células são consideradas VECs e produzir uma média de 61.800 células totais (amostras variam de 39,000-77,000 células / amostra) em amostras de adultos (n = 3), e 8928 células (8,015- 11.000 células / litro) de uma ninhada de embriões E14.5. Análise de PCR confirma enriquecimento de marcadores de células endoteliais em células GFP positivas e válvulas marcadores de células intersticiais em células GFP-negativos isolados de camundongos Tie2-GFP. Gene análise da GFP populações positivas e negativas celulares por qPCR seguintes FACS expressão mostram perfis moleculares distintos. Em comparação com populações de células de GFP isolado a partir de embriões negativo Tie2-GFP e adults, as células positivas para GFP são enriquecidas para a expressão de marcadores de células endoteliais CD31 e vWF, (Figura 3). Além disso, a expressão de marcadores de miócitos (Myh6, MYH7) nestas populações de células é muito baixo, demonstrando a contaminação mínima das células não endoteliais. Em contraste, as células GFP negativos isolados de camundongos adultos Tie2-GFP e embriões E14.5 são enriquecidos para válvula célula intersticial (VIC), marcadores de células positivas α-SMA e periostin (POSTN) em relação ao GFP. Enriquecimento destes marcadores é superior em células negativas para GFP isolado a partir de amostras de E14.5 comparados com os adultos devido ao fenótipo quiescente da VICs adultos e, por conseguinte, de baixa expressão de marcadores activados. Células GFP positivas isoladas a partir de ratinhos adultos Tie2-GFP podem ser cultivadas in vitro. A capacidade de cultura de células GFP positivas e negativas GFP isoladas de amostras de adultos foi examinado de based na morfologia celular e coloração imuno-histoquímica. Usando protocolos anteriormente descritos por nós 17 que mostram na Figura 4, que as células GFP positivas aparecem rodada em morfologia (Figura 4A) e co-express de GFP com o marcador celular endotelial CD31 após duas semanas de cultura (Figura 4C). Em contraste, as células endoteliais não são negativas para GFP, exibe uma morfologia mesenquimal semelhante (Figura 4B) e expressam o marcador VIC α-SMA, após nove dias (Figura 4D). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1. células Tie2-GFP-positivas com a co-localizar CD31 em válvulas cardíacas embrionários e adultos. Imunofluorescência para mostrar associação de (Tie2-) expressão da GFP (A, B) com o marcador celular endotelial, CD31 (C, D) em os sfolhetos eptal da válvula mitral em E14.5 (A, C, E) e adulto (B, D, F) etapas. A região da válvula é destaque na A, C, E. (E, F) imagens fundidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. VECs Tie2-GFP-positivas pode ser identificada por FACS. Comparado com os controlos C57 / Bl6 pareados por idade (A, C), as válvulas isoladas a partir de embriões de Tie2-GFP (B) e adultos (D) conter um GFP distinta população de células positivas, como indicado em verde. Eventos GFP-negativo, mostrado em vermelho foram recolhidos como um controlo. Os números em (B) e (D) indicam a média% de GFP-pcélulas ositive do número total de eventos ordenados por FACS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. células GFP positivas são enriquecidos para os marcadores de células endoteliais enquanto que as células de GFP-negativas expressam genes associados com as células intersticiais de válvula. Representativas qPCR de marcadores de células endoteliais (CD31, Factor de von Willebrand (vWF)) e adultos (Myh6) e fetal ( MYH7) marcadores de miócitos nas células GFP positivas isoladas de regiões valvulares do E14.5 (A) e de adulto (B) ratinhos Tie2-GFP. Nota enriquecimento de marcadores de células endoteliais e níveis muito baixos de genes associados a miócitos. (C, D) Fold chaNGES na expressão de marcadores de células intersticiais de válvulas α-SMA e POSTN em células GFP-negativas isoladas de E14.5 (C) e adulto (D) ratos Tie2-GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. células Tie2-GFP positivas manter a expressão de marcadores de células endoteliais in vitro. Seguindo FACS, GFP positivas (A, C) e negativo (B, D) de populações de células de ratos adultos foram cultivadas até à confluência e sujeitas a eliminação progressiva de imagem contraste (A, B) e imunocoloração fluorescente (C, D). Células GFP positivas expressam CD31 (vermelho) (C) depois10 dias de cultura. Em contraste, a expressão da GFP não foi detectada na população de células negativa, que corado positivo para α-SMA, um marcador de VICs activados (D).

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Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

isolation-of-murine-valve-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K visualizações.  The Ohio State University. The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Vídeo: Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biologia

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) play an important role in the calcification process in aortic stenosis through the activation of their dedifferentiation program to osteoblast-like cells. Mouse VICs are a good in vitro tool for the elucidation of the signaling pathways driving the mineralization of the aortic valve cell. The method described herein, successfully used by these authors, explains how to obtain freshly isolated cells. A two-step collagenase procedure was performed with 1 mg/mL and 4.5 mg/mL. The first step is crucial to remove the endothelial cell layer and avoid any contamination. The second collagenase incubation is to facilitate the migration of VICs from the tissue to the plate. In addition, an immunofluorescence staining procedure for the phenotype characterization of the isolated mouse valve cells is discussed. Furthermore, the calcification assay was performed in vitro by using the calcium reagent measurement procedure and alizarin red staining. The use of mouse valve cell primary culture is essential for testing new pharmacological targets to inhibit cell mineralization in vitro.

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

This article describes the isolation of mouse aortic valve cells by a two-step collagenase procedure. Isolated mouse valve cells are important for performing different assays, such as this in vitro calcification assay, and for investigating the molecular pathways leading to aortic valve mineralization.

Isolamento de células válvulas intersticiais do rato para estudar a calcificação da válvula aórtica in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

Isolamento de Células Valvares Primárias Humanas para Modelagem de Doenças In Vitro

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolando células endoteliais de capilares linfáticos dérmicos murinos

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

Autor em destaque: Isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...