O estudo é apoiado por EUA Public Health Service Grant DK-081527, 072473 e DK-DK-20595 para a Universidade de Chicago Diabetes Centro de Pesquisa e Treinamento (Core modelos animais), e um presente da Fundação Família Kovler.

1. Criar Slices Virtual de imunohistoquímica Imagens Stained <ol><li> StereoInvestigator aberto. Coloque a lâmina limpa segurando a amostra no porta-microscópio e visualizá-lo em Stereo Investigator, clicando em &quot;Aquisição&quot; e depois &quot;Image Live&quot; (Image Acquisition → Live). Determinar níveis de exposição para cada canal, em nosso exemplo específico, o Canal 2 é usado para DAPI, Canal 3 para GFP, Channel 4 para a RFP, Channel 5 para Cy5 e Canal 6 para Cy7. Use o &quot;Video Histograma&quot; janela, que exibe a intensidade da fluorescência, para determinar o nível de exposição. Apropriada intensidades de fluorescência são alcançados quando as caudas intensidade fora na extremidade direita do histograma de vídeo. Níveis de exposição pode ser alterado na &quot;Camera Settings&quot; janela. O Histograma de vídeo podem ser focado com a roda de foco do microscópio. </li><li> Antes de criar um Slice Virtual, contorno da amostra clicando na tela em um ponto de distância da amostra, que marcará um ponto de referência, e em seguida, clicando em todo o contorno da amostra. Quando o contorno é completa, clique direito e selecione &quot;Contour Close&quot; para ligar os pontos inicial e final. </li><li> Uma vez que o contorno é fechado, a captura de um Virtual Slice para a amostra (Aquisição → Adquirir Slice Virtual). Quando as opções Slice Virtual janela aberta, selecione &quot;Alta Velocidade Adquirir&quot;, bem como foco automático, desmarcando a caixa ao lado de &quot;Manual&quot;. Salve o arquivo. </li><li> A fatia virtuais pré-focagem deve ser calibrado, selecionando (botão direito → Adicionar à Lista Foco Site) e manualmente focando várias seções aleatória, ou seja, sites, na pré-visualização Slice Virtual. Quando vários sites têm sido focados, inicie o Slice Virtual (clique direito → Iniciar Slice Virtual com Pré-focagem). Após a Slice Virtual para a primeira amostra estiver completa, mudar para o canal seguinte e ajustar a exposição de acordo. Repita os passos 4 e 5 para cada canal. </li></ol> 2. Assistida por computador Análise Bidimensional Quantificação de Ilhotas <ol><li> As imagens são então processadas usando uma macro ImageJ chamado &quot;IHCVS&quot;, que primeiro se prepara imagens carregadas para análise e, em seguida, quantifica características de ilhotas como a composição celular (ou seja, cada área de beta, alfa-e delta-célula populações e ilhotas área no valor da soma). A pilha é dividida em canais separados em ImageJ, onde cada canal mostra uma imagem separada com base na coloração imuno-histoquímica. Cada imagem é então automaticamente thresholded, após o qual uma imagem de 8 bits em preto e branco, ou uma máscara, da imagem thresholded é produzido. As imagens canal separado são somados aritmeticamente em uma máscara composta, e análise de partículas ImageJ built-in é efectuado na imagem composta. </li><li> ROIs são então identificadas, excluindo partículas menores que uma célula beta única (&lt;M 170 2; área calculada usando um diâmetro de ~ 15 mm; Hara et al, 2003).. Os ROIs resultantes são analisados ​​e quantificados utilizando ImageJ; quantificação pode incluir perímetro (uma distância em torno de uma área), a circularidade (um grau de circularidade, onde o número de 1,0 descreve um círculo perfeito), diâmetro Feret (a maior distância dentro de uma área) e centro coordenadas para cada região analisada, para que a distribuição das ilhotas podem ser analisados ​​matematicamente usando várias combinações desses parâmetros e plotados em um gráfico 3D, os dados dos quais serão utilizados para modelagem matemática. Uma imagem única fatia virtual é analisado em 30 segundos. Várias imagens podem ser analisadas através de encaixar o processamento de imagem e roteiro de análise em uma sintaxe de loop suportado pelo ImageJ linguagem macro. O laço abre todos os arquivos em um determinado diretório, analisa as imagens, e saídas resultados em um novo local como um arquivo de Excel. </li><li> Os resultados agregados são salvos em uma planilha do Excel, armazenamento de dados como área, perímetro, circularidade, diâmetro Feret, e centro para cada ilhota ilhota, junto com números correspondentes rotulados na imagem. </li></ol> Análise computacional e Setup Histograma <ol><li> Scripts Mathematica, que funcionam automaticamente, uma vez iniciados, são utilizados para processar os dados da planilha coletados, no valor de centenas de milhares de entradas. Um dos processos críticos que são executados é uma análise de freqüência, que constrói um histograma usado para examinar distribuição de tamanho e também para determinar outliers nos dados. De acordo com o roteiro, a área total de ilhotas é medido e comparado a outros parâmetros, sobretudo a pontos de tempo ou a idade do pâncreas, e, em seguida, de acordo apresentada em um gráfico. </li></ol> 3. Reconstrução tridimensional de Dois Dimensional imunohistoquímica Stained Imagens Slice Virtual Reconstrução 3D de Fatias Virtual <ol><li> Copie o script (&quot;im_jp2_2_tiff&quot;) para o diretório (ou seja, pasta) quecontém o jp2 imagens. Executar o script com o shell do Linux digitando &quot;./im_jp2_2_tiff&quot; no console e pressionando enter. Este script irá converter automaticamente todos os jp2 imagens no diretório em arquivos de tiff, que é o formato usado na construção e quantificação de pilhas tridimensionais do Fatias Virtual. (Nota:. Digite &quot;chmod + x im_jp2_2_tiff&quot; se o script não for executado, o que irá converter o arquivo de texto em um script para que ele possa funcionar corretamente) </li><li> Quando todas as imagens capturadas foram convertidos para arquivos de jp2 tiff, eles estão prontos para ser usados ​​para análise em ImageJ. </li><li> Com ImageJ, abra todas as imagens para a primeira amostra (cinco imagens neste caso: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) e fundi-los como uma imagem (Imagem → Cor → Mesclar canais). Repita esse processo para cada uma das amostras. Quando todas as amostras foram combinadas como únicas imagens, limpar as imagens, selecionando regiões indesejadas com o &quot;Polígono Selections&quot; ferramenta e enchendo-os em (Editar → Fill). (Redimensionar as imagens para um tamanho menor, se necessário). Em seguida, converter cada imagem em uma imagem de cor RGB (Imagem → → Tipo de cor RGB). Finalmente, criar uma pilha a partir de imagens (Image → Imagem → para Stacks Stacks), após o que pode ainda estar alinhado com o &quot;Stack Reg&quot; plugin, se necessário. Em última análise, a fusão dos canais e, em seguida, combinando as imagens cria uma montagem 3D de todas as ilhotas no pâncreas inteiro. Para ver a imagem, clique em &quot;Plugins&quot; e então &quot;visualizador em 3D.&quot; </li></ol> 4. Mapeamento Islet Coleta de Pilhas de imagens <ol><li> Situar as ilhotas pancreáticas toda montagem sob o microscópio. </li><li> Abra o software Slidebook. O acesso a &quot;Captação e Controle de Foco&quot; pressionando &quot;Ctrl + Shift + E.&quot; No &quot;Controle de Foco&quot; janela, defina o objetivo de 20X ou 40X, dependendo do tamanho da ilhota. Aplique água se estiver usando uma lente objetiva de imersão de água. </li><li> A fim de utilizar a ocular do microscópio para localizar ilhotas, set &quot;Bin&quot; para 2X e definir o conjunto de filtros para User1 na &quot;Controles Focus&quot; janela. &quot;Seleção de Emissão&quot; deve ser ajustado para Olhos 100% e densidade neutra para 1. Clique em &quot;GFP ey&quot; e depois &quot;Open Fluor.&quot; </li><li> Para visualizar a amostra em Slidebook, volte para o Focus Controles janela e switch &quot;Set Filter&quot; para &quot;Live&quot; e clique em &quot;boas práticas agrícolas ds&quot;. Use o joystick para o centro da ilhota na janela Camera 1, bem como possível. Foco para uma profundidade em algum lugar perto do centro da ilhota, onde as células podem ser distinguidas facilmente. </li><li> Na &quot;Janela controla o foco&quot;, selecione a guia &quot;Z&quot;. Clique set no canto superior esquerdo da janela para definir a profundidade atual como um ponto de referência. Use o controle de escopo para se deslocar até a profundidade superior da ilhota em que recursos podem ser discernido claramente e clique em &quot;Set Top&quot;. Vá até o final do ilhéu e clique em &quot;Bottom Set&quot;. Clique em &quot;Go&quot; para voltar ao ponto de referência. </li><li> Na janela de captura, set &quot;Fator de Bin&quot; para &quot;2X&quot; e definir &quot;Set Filter&quot; para &quot;Live&quot;. Definir o &quot;Tipo de Captura&quot; para &quot;3D&quot; (e só em 3D). No lado direito da janela, clique em &quot;Use Posições Superior e Inferior.&quot; Clique em &quot;Return to Ponto de Referência após a captura.&quot; Definir o &quot;Tamanho do Passo&quot; para &quot;3&quot;. </li><li> Sob o &quot;Box Set Filter,&quot; select DAPI DSU, GFP DSU, RFP DSU, e Cy5 Dsu. Para cada uma, clique em &quot;Find Best&quot; em &quot;Ajuste da exposição&quot;, depois clique em &quot;Test&quot; para se certificar de que a exposição seleccionado é apropriado. Clique em &quot;Iniciar&quot; para iniciar a captura. </li><li> Quando a captura for concluída, ajustar os níveis como necessárias e mudar a cor exibida para RFP para branco. Salvar o slide e vá em Exibir → Exportar → TIFF série. Digite o nome do slide com um traço no final e salvá-lo. Dezenas de arquivos TIFF individuais são criados, por isso pode ser útil para manter a pilha de cada ilhota de imagem em uma pasta separada. </li></ol> Mapeamento Stacks Imagem <ol><li> Abra Investigador Stereo. Visualize a imagem abrindo as pilhas de imagens (Arquivo → Stack Stack Imagem Imagem → Open). No &quot;menu Escala de imagem,&quot; set &quot;distância entre as imagens&quot; para 3,00 mM. Para corrigir binning 2X em Slidebook, selecione &quot;Override X e Y Scaling&quot; e &quot;usuário especificado para Fonte de X e Y&quot; Scaling, e digite 0,65 para ambos X e Y. </li><li> Centralizar a imagem clicando no meio da ilhota de interesse na &quot;janela Macro.&quot; Marcar pelo menos uma célula usando o marcador apropriado. Células-beta aparecerá verde, células alfa aparecerá vermelho, e as células delta aparecerá branco; marcador use 2 (um círculo vazio) para marcar as células-beta, Marker 5 (um triângulo oco) para marcar as células alfa, e Marker 6 ( um triângulo vazio) para as células delta. Células devem ser marcadas no centro de seu núcleo, que aparecem em azul se a amostra foi corado com DAPI. </li><li> Uma vez que pelo menos uma célula tem sido marcado, exibir o &quot;Ver Orthogonal&quot; usando o ícone no menu superior. Marque a opção &quot;Z-Filter&quot; e &quot;Symmetric&quot;. O s gamahould ser ajustado às 15h00. Começando no nível 0,0 Z, percorra a ilhota usando a roda do mouse e marcar cada célula com o marcador apropriado. Cada célula deve ser marcada apenas uma vez no centro da sua profundidade. Ao terminar marcando cada um dos níveis-Z, o &quot;Z-filtro&quot; checkbox pode ser desmarcada. Isto irá mostrar todos os marcadores de todos os Z-níveis. </li><li> Quando cada célula tem sido marcada, salve o arquivo como um &quot;DAT&quot; arquivo, então vá ao menu Arquivo → Exportar Tracing. Salvar o rastreamento como uma &quot;TXT&quot; arquivo. Clique em &quot;novo arquivo de dados&quot; para limpar o espaço de trabalho antes de tentar mapa ilhotas novo. </li></ol> 5. Resultados representativos: A preparação de fatias Virtual a partir de uma amostra de pâncreas imunohistoquímica manchada capacita a pessoa a examinar todas as células endócrinas (alfa, beta e delta-células) no pâncreas todo, tanto em conjunto como ilhotas (Figura 1A) e individualmente em canais separados ( Figura 1B). Com o auxílio de programas de computador e scripts, uma análise de massa de dados em grande escala podem ser realizadas sobre essas fatias Virtual. Especificamente, a análise de partículas de máscaras composto (Figura 1C) é a saída como uma tabela contendo estatísticas parâmetros como ilhéu área, perímetro (a distância em torno de uma área), a circularidade (um grau de circularidade, onde 1.0 representa um círculo perfeito), e Feret diâmetro (a maior distância dentro de uma área) para cada ilhota detectado (Figura 1D). A análise de larga escala destes resultados imagens na produção do número de ilhotas total e histogramas distribuição de tamanho, bem como uma comparação detalhada de alfa-, beta-e delta-célula áreas. Além disso, cada Slice Virtual é levado a uma profundidade de aproximadamente 5 mm, e todos do indivíduo 2D Slices Virtual são ainda empilhadas para criar uma reconstrução 3D da amostra de pâncreas inteiro. Mapeamento das ilhotas demonstra outra instância, não só de capturar ilhotas em 3D, mas também de análise assistida por computador detalhadas. Mapeamento de ilhotas consiste na captura de ilhotas distintos (Figura 2A) ea subsequente marcação de alfa, beta-e delta-células em várias Z-aviões (Figura 2B) para visualizar uma ilhota em 3D (Figura 2C, D). Análise matemática automatizado de ilhotas mapeadas exibe sua composição celular e arquitetura, incluindo a célula-distâncias (Figura 2E) e distribuições de probabilidades cumulativas de célula-distância (Figura 2F). <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Grande escala de captura e análise da distribuição das ilhotas usando Slice Virtual. A. slices Virtual de uma seção de pâncreas humano. a. Coloração imuno-histoquímica de insulina (verde), glucagon (vermelho), somatostatina (branco) e DAPI (azul). b. Convertidos de 8 bits da máscara após limiarização automática. A área de box é ampliado no BB Visualizações de cada canal. a. delta-células, b. células-beta, c. alfa-células, e d. fundiram imagem composta. C. A análise da partícula efectuadas sobre máscara de composto. Note-se que cada estrutura de ilhotas incluindo grupos de células pequenas é numerado (destaque em azul). D. Estatísticas tabela de vários parâmetros medidos para estruturas individuais, que têm IDs que correspondem às etiquetas mostrado na C. <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig2.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 2. Análise de Slice Virtual imuno-histoquímica. A. gráfico de dispersão 3D da Figura 1 mostra o tamanho ea forma de distribuição de cada ilhota por parâmetros como área, circularidade e diâmetro Féret. B. gráfico de dispersão 3D da Figura 1 mostra a composição celular das ilhotas e tamanho. C. distribuição de tamanho de Islet da análise seção inteira humana a partir da Figura 1 equipado com uma distribuição lognormal densidade de probabilidade. D. Análise Matemática dos rácios de composição celular (células-beta em verde, as células alfa-delta em vermelho e as células em azul) para cada bin diâmetro das ilhotas eficaz da Figura 1. E. a. Islet distribuição de tamanho de análise de amostragem aleatória imuno-histoquímica (esquerda). Islet distribuição de tamanho de análise fatia virtual (direita). b. Log-normal comparação trama de análise de amostragem aleatória imuno-histoquímica (vermelho) e fatia virtual (azul). <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Islet mapeamento e análise matemática da composição celular e arquitetura. A: captura de tela que mostra um único plano focal de uma pilha de reconstrução 3D de imagens de uma ilhota humano carregado em Stereo Investigator (beta-células em verde, alfa-células em vermelho, delta-células em branco, e núcleos em azul) . B: imagens de fluorescência (esquerda) e correspondentes dados mapeados (direita) em três diferentes planos focais mostrado em um intervalo de 10 mM. C: Vista Representante de dados de mapeamento 3D reconstruídas das ilhotas. D: reconstrução 3D do quarto em fatias ilhota com base nas coordenadas obtidas pelo mapeamento das ilhotas. E: A análise matemática da composição celular e arquitetura. Left. Freqüência relativa de célula a célula, as distâncias entre as duas células em uma população única célula. Direita. Freqüência relativa de célula a célula, as distâncias entre as duas populações celulares diferentes. F: Kolmogorov-Smirnov (KS). Esquerda. Probabilidades cumulativas de célula a célula à distância para distribuições alfa-to-alfa, beta-de beta-e delta-to-delta células. Direita. KS distâncias para o correspondente três probabilidades cumulativas.

<ol>
	<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity+-+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> ISLETS. 2, 135-145 (2010).</li><li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l., Kilimnik, G., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture+-+a+comparative+study.">Islet architecture - a comparative study.</a> ISLETS. 1, 129-136 (2009).</li><li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice.">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li><li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li><li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O assistida por computador visualização de grande escala e quantificação apresentada aqui pagar quatro pontos-chave em estudos de ilhotas pancreáticas: (1) A análise de larga escala de espécimes pancreático oferece uma visão abrangente da distribuição global de ilhotas tamanho e arquitetura da ilhota. (2) A reconstrução em 3D e análise matemática da composição celular e arquitetura facilitar ainda mais a análise do arranjo espacial de células endócrinas dentro de uma ilhota. (3) plasticidade ilhota S...

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<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Olympus </td>
<td>IX-81
</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Investigator</td>
<td>Program</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MIP-GFP mice</td>
<td>Mice</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mathematica</td>
<td>Program</td>
<td>Wolfram</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Image J</td>
<td>Program</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slidebook</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Program</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture

A ilhota do pâncreas é um órgão único micro-composto de várias células secretoras de hormônio endócrino, tais como células-beta (de insulina), alfa-células (glucagon), e células-delta (somatostatina) que são incorporados nos tecidos exócrinas e compreendem 1 - 2% do pâncreas inteiro. Há uma estreita correlação entre o corpo eo peso do pâncreas. Massa das células beta total também aumenta proporcionalmente para compensar a demanda por insulina no organismo. O que escapa dessa expansão proporcional é a distribuição de tamanho de ilhotas. Animais de grande porte, tais como os seres humanos compartilham distribuições de ilhotas de tamanho similar com camundongos, sugerindo que este órgão tem um micro-determinado limite de tamanho para ser funcional. A incapacidade dos animais de grande porte pancreata para gerar ilhotas proporcionalmente maior é compensado por um aumento no número de ilhotas e por um aumento na proporção de ilhotas maior em sua distribuição geral das ilhotas tamanho. Além disso, ilhotas exibem uma plasticidade impressionante na composição celular e arquitetura entre diferentes espécies e também dentro da mesma espécie em diferentes condições fisiopatológicas. No presente estudo, descrevemos novas abordagens para a análise de dados de imagem biológica, a fim de facilitar a automação de processos analíticos, que permitem a análise de coletas de dados grandes e heterogêneas no estudo de processos biológicos, tais dinâmicas e estruturas complexas. Tais estudos foram prejudicados devido a dificuldades técnicas de amostragem imparcial e gerando grande escala conjuntos de dados precisamente captar a complexidade dos processos biológicos da biologia das ilhotas. Aqui nós mostramos métodos para coletar imparciais &quot;representante&quot; de dados dentro da disponibilidade limitada de amostras (ou para minimizar a coleta de amostras) e as configurações padrão experimental, e analisar com precisão a estrutura tridimensional e complexa do ilhéu. Assistida por computador a automação permite a recolha e análise de conjuntos de dados em grande escala e também assegura a interpretação imparcial dos dados. Além disso, a quantificação precisa da distribuição de tamanho das ilhotas e coordenadas espaciais (ou seja, X, Y, Z-posições), não só leva a uma visualização precisa da estrutura das ilhotas pancreáticas e composição, mas também nos permite identificar padrões durante o desenvolvimento e adaptação às condições alterando através da modelagem matemática. Os métodos desenvolvidos neste estudo são aplicáveis ​​a estudos de muitos outros sistemas e organismos também.

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Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Métodos assistidos por computador romance de grande escala de aquisição e análise de amostras de imunohistoquímica do pâncreas manchadas são descritos: (1) capturar Slice Virtual de toda a seção, (2) a análise em massa de dados em grande escala, (3) Reconstrução de 2D Slices Virtual ; (4) mapeamento 3D ilhéu, e (5) Análise Matemática.

Assistida por computador visualização de grande escala e Quantificação da Missa das ilhotas pancreáticas, distribuição de tamanho e Arquitetura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

computer-assisted-large-scale-visualization-quantification-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K visualizações.  University of Chicago. Métodos assistidos por computador romance de grande escala de aquisição e análise de amostras de imunohistoquímica do pâncreas manchadas são descritos: (1) capturar Slice Virtual de toda a seção, (2) a análise em massa de dados em grande escala, (3) Reconstrução de 2D Slices Virtual ; (4) mapeamento 3D ilhéu, e (5) Análise Matemática.

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Biologia

Murine Pancreatic Islet Isolation

Isolamento Islet murino de pâncreas

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic beta-cell proliferation and islet growth is particularly challenging. We have developed a method to capture the distribution of beta-cells in the intact pancreas of transgenic mice with fluorescence-tagged beta-cells with a macro written for ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Following pancreatic dissection and tissue clearing, the entire pancreas is captured as a virtual slice, after which the GFP-tagged beta-cells are examined. The analysis includes the quantification of total beta-cell area, islet number and size distribution with reference to specific parameters and locations for each islet and for small clusters of beta-cells. The entire distribution of islets can be plotted in three dimensions, and the information from the distribution on the size and shape of each islet allows a quantitative and qualitative comparison of changes in overall beta-cell area at a glance.

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

The following protocol outlines the process of pancreatic dissection for virtual slice imaging, and the subsequent quantification of all GFP-tagged beta-cells in the entire pancreas.

Quantificação em situ da Missa das células beta pancreáticas em camundongos

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Ensaio para a grande escala Applications genotipagem

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Um método inovador para exossomo Quantificação e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...