Reconhecemos com gratidão o grupo de biologia de células Beta UMass Diabetes centro de excelência para as discussões e conselhos úteis. Ilhotas pancreáticas humanas foram fornecidas pelo NIDDK-financiado integrado ilhéu distribuição programa (IIDP) na cidade da esperança. Este trabalho foi financiado pelo NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) e pela Associação Americana de Diabetes conceder #1-15-BS-003 (LCA) em colaboração com a ordem do Amaranto.

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo Comitê de uso e UMass Medical School institucional Animal Care. Estudos de ilhota humana foram determinados pelo Conselho de revisão institucional de UMass não qualificar para revisão do IRB ou isenção porque não envolvem o uso de cobaias humanas.
1. cultura e isolamento ilhéu
<ol><li>Ilhotas de isolar e separar de contaminar o tecido exócrino e ductal, usando o método de sua escolha. Nota: Este método foi otimizado usando ilhotas isoladas por insuflação ductal colagenase e Cyp2e1 separação12 (roedores) ou pós-embarque ilhotas do programa de distribuição integrada ilhéu (IIDP13; humanos). Ilhéus foram escolhidos a dedo com uma micropipeta P200.</li>
	<li>Para otimizar a morfologia do Ilhéu, permitir ilhotas de recuperar durante a noite em 10 mL de meio de ilhéu completa (RPMI com 10% FBS, penicilina/estreptomicina e glicose 5,5 mmol/L) numa câmara umidificada contendo 5% CO2 a 37 ° C. Embora este passo não é necessário para obter as seções, os ilhéus são mais intactos após um período de recuperação (consulte a Figura 2).</li>
</ol>2. ilhéu fixação
<ol><li>Usando uma ponta de P200 baixa-ligação, escolher aproximadamente 250 ilhéu equivalentes (IEQ)13 usando uma grade calibrada sob um estereomicroscópio em um tubo de microcentrífuga de ligação baixa 1,5 mL. Dicas e tubos de ligação de baixa reduzem a perda de ilhéu.</li>
	<li>Permitir que Ilhéus repousar no fundo do tubo de microcentrífuga. Remova o sobrenadante mais com uma ponta da pipeta P200, tomando cuidado para não remover qualquer ilhotas.</li>
	<li>Adicione 1 mL de PBS. Centrifugar o tubo em uma centrífuga de balde balançando até a velocidade atinge 200 x g e depois parará o spin. Remova o sobrenadante. Repita a lavagem PBS, para um total de duas lavagens.</li>
	<li>Adicione 500 µ l de solução de formalina 10% ou paraformaldeído 4% acabadas. Fixar-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Para os resultados testados neste método, estes métodos de fixação eram indistinguíveis. Fixação mais curta também pode ser possível; é recomendável para otimizar a duração de fixação para o resultado desejado.</li>
	<li>Retire o fixador com uma ponta de P200.</li>
	<li>Adicione 1 mL de PBS. Tubo de centrifugação até a velocidade atinge 200 x g e depois parará o spin. Remova o sobrenadante. Repita a lavagem PBS, para um total de duas lavagens.</li>
	<li>Dirijam-se para a próxima etapa.</li>
</ol>3. preparação do Ilhéu disco (Figura 1)
<ol><li>Na primeira utilização, derreta o gel (por exemplo, Histogel) a 70 ° C e faça alíquotas em 1,5 mL a tubos de microcentrífuga para armazenamento a longo prazo. Volume alíquota não é crítica, pois alíquotas podem ser reutilizadas.</li>
	<li>Aquecer o gel (aproximadamente 100 µ l por amostra) a 70 ° C, colocando o tubo de microcentrífuga contendo gel de alíquota em um bloco de calor conjunto a 70 ° C.</li>
	<li>Transferi contas de agarose azul (10 µ l de cada amostra) em um tubo de microcentrífuga limpos de 1,5 mL. Resuspenda minuciosamente as contas antes de pipetagem. Nota: Grânulos azuis são misturados com os ilhéus para auxiliar na identificação visual do material incorporado no botão de agarose e o bloco de parafina. O número de grânulos azuis usado não é crítico para o resultado, mas evitar excessivos grânulos (> 5 x o número de ilhotas) para permitir a distribuição ideal de ilhotas em seções.</li>
	<li>Lave os grânulos azuis com 1mL de PBS, duas vezes. Para cada lavagem, gire os grânulos 1 min a x 800 g. Após a segunda lavagem, resuspenda os grânulos em (n+ 2) x 10 µ l de PBS, onde n é o número de tubos de amostra; por exemplo, para 2 tubos de amostra, o volume de PBS para adicionar as contas seria 40 µ l.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de microcentrífuga contendo ilhotas (breve spin para x 200g) e remover a maior parte do sobrenadante. Corte a ponta de uma dica de micropipeta de 10 µ l com tesoura ou lâmina e adicionar 10 µ l de grânulos para cada tubo ilhéu, usando uma ponteira limpa para cada amostra. Não misture (para evitar a perda de Ilhéus).</li>
	<li>Centrifugação de Ilhéus e grânulos (breve spin para 200 x g). Remova o PBS tanto quanto possível com uma ponta de micropipeta de 10 µ l sem cortes.</li>
	<li>Rotule as corrediças do microscópio para a identificação da amostra. Duas ou três amostras podem ser preparadas em cada slide. Coloque o slide no banco perto do bloco de calor com gel aquecida. Corte as pontas de três a cinco 20 pontas de micropipeta de baixa vinculação µ l por amostra com uma lâmina de barbear ou tesoura. Carrega duas micropipetas P20 com dicas de corte para permitir a rápida mudança de um para o outro.</li>
	<li>Usando a primeira micropipeta, adicionar 15 a 20 µ l de gel quente para o tubo de microcentrífuga Ilhéus/grânulos; imediatamente misture, evitando bolhas; e aplique a mistura líquida de agar/Ilhéus/grânulos para o slide para formar um < disco de diâmetro de 1 cm. Coloque o disco perto da borda do slide, deixando espaço para o anel exterior gel (próximo passo). Toque o slide suavemente várias vezes para acertar as ilhotas e grânulos.</li>
	<li>Usando uma segunda micropipeta, adicione 20 µ l de gel quente para o tubo de amostra. Em seguida, usando a primeira micropipeta, mistura novo gel com qualquer restantes Ilhéus/grânulos, re-aquecimento do bloco de calor se ele começa a se solidificar, aplica esta mistura para o slide, cercando o disco original. Repita, se necessário, usando dicas adicionais pré-cortada, até que o disco é o tamanho desejado e espessura. Nota: Manipular o disco gelificado é mais fácil se o anel exterior é ligeiramente mais grosso. Geralmente, 3 x 20 µ l de gel é suficiente. Esta etapa minimiza a perda de Ilhéus pelo tubo lavagens e adiciona agarose ilhéu-pobres para o exterior do disco para facilitar a manipulação de disco.</li>
	<li>Prepare-se individualmente a cada disco e manter o controle cuidadoso da ordem da amostra se colocar vários discos em cada slide.</li>
	<li>Coloque os slides sobre uma superfície plana de gelo molhado, com uma tampa, por 10 minutos ou até que o gel se solidifica. É mais difícil deslizar o disco fora do vidro se seca para fora.</li>
	<li>Biópsia de rótulo processamento/incorporação de fitas de tecido com lápis, um por exemplo. Seca a parte de trás do slide para evitar molhar o papel azul.</li>
	<li>Utilizando a extremidade sem corte de uma lâmina de barbear, empurre suavemente o disco em cada direção para livrá-lo do copo. Quando desliza facilmente, empurre lentamente o disco da lâmina de microscópio para o papel de tecido azul. Coloque o disco, o lado liso para baixo, diretamente no papel.</li>
	<li>Mantendo o disco liso, dobre o papel ao redor do disco para evitar o movimento, coloque o disco no papel dobrado na gaveta e fechar a gaveta. Se o disco não deslizar limpa do copo, adicionar mais gel e/ou retornar a corrediça para gelo por mais alguns minutos.</li>
	<li>Mergulhe a fita em PBS num copo. Processo para incorporação no mesmo dia para morfologia ideal de parafina.</li>
</ol>4. parafina incorporação
Nota: O gel do Ilhéu de processo discos para blocos de parafina, usando uma série de desidratação abreviado conforme descrito abaixo. Esta técnica foi otimizada usando um processador automatizado, mas processamento manual deve produzir resultados semelhantes.
<ol><li>Mergulhe fitas em 85% de etanol durante 15 minutos.</li>
	<li>Mergulhe fitas em etanol a 95% por 15 minutos.</li>
	<li>Mergulhe fitas em etanol 100% por 15 minutos. Repita duas vezes para um total de três lavagens.</li>
	<li>Mergulhe fitas em xilol durante 15 minutos. Repita duas vezes para um total de três lavagens.</li>
	<li>Mergulhe fitas em parafina derretida por 10 minutos.</li>
	<li>Transferi fitas para fresca parafina derretida por 10-30 minutos.</li>
	<li>Cuidadosamente Abra a gaveta e desembrulhei o papel azul. Retire o disco de gel, mantendo-se a par da superfície plana que se opunha ao jornal. Inserir o disco em um molde pequeno, com a superfície plana (contendo ilhéu) para baixo, paralelo à superfície de corte. Para a ficha, cuidadosamente retire a gaveta e incorporá-lo em um molde pequeno com a ponta apontando em direção à superfície de corte.</li>
</ol>5. parafina, corte e coloração
<ol><li>Rotular slides em sequência se seções seriais são necessárias.</li>
	<li>Têm 5 µm parafina seções cortadas por um histotechnologist experiente. Para maximizar o rendimento, salve todas as seções que contenham material. Geralmente, coletar 20 seções permite a captura da maioria do material.</li>
	<li>Armazenar as seções à temperatura ambiente. As seções são favoráveis à rotina histológicas manchas (por exemplo, H & E) e imunofluorescência (por exemplo, insulina, glucagon e DAPI). Otimize a fixação para outros antígenos, se necessário.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+architecture%3A+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li>
<li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li>
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<li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Induces+Mouse+%CE%B2-Cell+Proliferation+via+IRS2%2C+MTOR%2C+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li>
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<li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li>
<li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+cell+block+processing%3A+The+Cell-Gel+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li>
<li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+infusion+in+mice%3A+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li>
<li>Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://iidp.coh.org/">http://iidp.coh.org/</a> (2018).</li>
</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse para declarar.

Este método de encastre modificado baseados em gel-disco fornece um simples, barato e eficiente maneira de gerar um alto rendimento de ilhotas por seção. Construir o disco de gel sobre uma superfície plana de vidro facilita o espalhamento ilhotas em uma distribuição uniforme sobre uma área bem definida. Espalhar as ilhotas em um disco plano oferece a vantagem de colocar muitas ilhotas no plano da secção, otimizando o rendimento e permitindo menos ilhotas ser usado. A espessura do disco pode ser ajustada para ate...

Pancreáticas ilhotas de Langerhans, a única fonte de insulina, em circulação são um tecido crítico para os investigadores a estudar diabetes mellitus. De um determinado organismo, Ilhéus têm tamanho variável, frequência do tipo de célula e arquitetura1,2,3. A estratégia convencional para estudar na vivo estrutura e composição de células endócrinas das ilhotas pancreáticas é secionando pâncreas tecido4,5. Desde Ilhéus compõem apenas uma pequena fração do conteúdo total de celular do pâncreas, estudos moleculares são executados em ilhotas isoladas. Ex vivo ilhéu cultura experiências testando a resposta aos nutrientes, modulação de gene (transfeccao, transdução), ou tratamentos experimentais fornecem importantes insights sobre mecanismos de modulação da função, proliferação e sobrevivência de células endócrinas 5 , 6.
Ex vivo experimentos ilhéu frequentemente são analisados usando estudos moleculares de ilhotas inteira ou estudos histológicos ou moleculares das ilhotas dispersas células cultivadas em monocamada5,6. Análise molecular de ilhotas toda introduz a séria advertência entremear tipos de células, que podem produzir resultados falso-negativos ou falso-positivos quando extrapolados para qualquer tipo de célula individual. Dispersão de célula para lamínulas para microscopia de pós-cultura permite a medição de resultado de célula-tipo específico, mas interrompe a arquitetura do Ilhéu, que pode alterar a resposta à intervenção e impede a identificação dos resultados relacionados com arquitetura. Além disso, geralmente apenas um único resultado pode ser medido; por exemplo, para medir a proliferação de células beta e morte de células beta, nas mesmas condições, dois experimentos separados precisam ser executadas. Essas abordagens também são cegas à variabilidade inter ilhéu, uma área de interesse crescente no campo. Classificação células das ilhotas por citometria de fluxo para estudos moleculares de célula tipo-específicos, ou estudos de RNA de célula única são elegantes, mas caro, demorado, limitado pela abundância de tecido, erradicar a arquitetura e não é bem adequado para análises de cultura celular de rotina 5 , 7. imagem latente confocal de ilhotas immunostained toda a montagem fornece alta qualidade intacta-arquitetura dados, mas é trabalhoso, e dados obtidos de cada amostra são limitados aos resultados identificáveis em um único immunostaining8.
A capacidade de gerar seções de alta qualidade da parafina de ilhotas toda pós-cultura abordaria muitas dessas preocupações. Tecido de ilhéu de alto custo e baixa-abundância de modelos genéticos únicos ou de doadores de órgãos humanos, ou ilhotas status post vivo em ou em vitro experimental manipulação, são preciosos. Obtenção de várias seções de parafina de Ilhéus mesmos permitiria múltiplas análises específicas do tipo de célula, arquitetura intacta no mesmo experimento.
Técnicas existentes para gerar pelotas ilhéu para secionar são imperfeitas. Histologia-otimizado agarose é um gel aquoso baixo ponto de fusão que é amplamente utilizado no processamento de amostras histológicas e citológicas, incluindo amostras de tecido pequeno ou fragmentados que são difíceis de processo9. Um ilhéu, incorporando a abordagem é para suspender as ilhotas em agarose em um tubo de microcentrifugadora, centrifugar para o material de Pelotas, recuperar a ficha de agar, então processar e incorporar para secionar10,11. Extrair a amostra solidificada da parte inferior do tubo é demorado e difícil, levando a fragmentação ocasional da amostra e risco de danos pessoais. Os ilhéus concentram-se na ponta do plugue, levando a distribuição inadequada Ilhéu em seções obtidas por este método. O fundo redondo do plugue complica incorporando tais que uma região pobre em ilhéu possam ser apresentada para corte. Em geral, esse método leva ao baixo rendimento e distribuição ilhéu agrupados nas seções resultantes.
Este novo método é uma abordagem simplificada e melhorada para a preparação das seções do Ilhéu. Ilhotas são concentradas em um pequeno volume e então colocadas sobre a superfície lisa de uma lâmina de microscópio para formar um disco pequeno, com as ilhotas em um avião. O disco Histogel-ilhéu é processado posteriormente para incorporação em uma desidratação encurtada e protocolo de infiltração de xileno de parafina. A abordagem anterior, que concentra os ilhéus na parte inferior de um tubo de microcentrífuga, também é realizada como uma comparação. Essa nova técnica melhora o rendimento de ilhotas por seção, a distribuição das ilhotas em cada seção e leva menos tempo para transferir os blocos do Ilhéu para fitas. Essa técnica é útil para os biólogos ilhéu ou outros cientistas estudando pequenos pedaços de tecido que desejam maximizar produtivo usam de um baixa abundância tecido medindo vários resultados em uma única amostra em sua arquitetura de tecido nativo.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf tube</td><td>Norgen Bioteck Corp</td><td>P/N 10113&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ranin Classic Starter Kit</td><td>ShopRanin</td><td>17008708</td><td></td></tr><tr><td>Ranin ClassicPipette PR-2</td><td>ShopRanin</td><td>17008648</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (1000 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (200 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (20 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (10 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin solution</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Heatblock</td><td>VWR</td><td>949312</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Agarose blue beads- Affi-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processing cassette</td><td>Simport</td><td>M492-10</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Wraps</td><td>Leica-Surgipath</td><td>3801090</td><td></td></tr><tr><td>Citadel 2000 tissue processor</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>McCormick Scientific</td><td>39503002</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td>Finesse ME+</td><td></td></tr><tr><td>Insulin antibody</td><td>DAKO</td><td>A0564</td><td></td></tr><tr><td>Glucagon antibody</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield with DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td><td>Life technologies</td><td>A11076</td><td></td></tr><tr><td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr></tbody></table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

Experimentos utilizando ilhotas pancreáticas isoladas são importantes para a pesquisa do diabetes, mas ilhéus são caros e de abundância limitada. Ilhéus contêm uma população mista de célula em uma arquitetura estruturada que afeta a função e ilhotas humanas são amplamente variável na composição do tipo de célula. Atuais métodos usados com frequência para estudar ilhotas cultivadas incluem estudos moleculares, executados em toda Ilhéus, amontoando ilhéu diferentes tipos de células juntos, ou microscopia ou estudos moleculares em células das ilhotas dispersas, rompendo a arquitetura do Ilhéu. Estudos em vivo ilhéu, seccionamento de pâncreas de parafina é uma técnica poderosa para avaliar resultados de células específicas no ambiente nativo do pâncreas. Estudando a pós-cultura ilhotas secionando parafina que oferecem várias vantagens: deteção de vários resultados na mesmas ilhotas (potencialmente até as exato a mesma ilhotas, usando seções seriais), medições específicas do tipo de célula e mantendo nativo Ilhéu célula-célula e célula-substrato interações durante a exposição experimental e para análise. No entanto, as técnicas existentes para a incorporação de isolaram ilhotas pós-cultura são ineficientes, demorado, propenso a perda de material e geralmente produzem seções com números ilhéu inadequada para ser útil para quantificar os resultados. Instalações da preparação do bloco de célula laboratoriais de patologia clínica são inacessíveis e impraticável para laboratórios de pesquisa básica. Nós desenvolvemos um método de bancada melhorado e simplificado que gera seções com rendimento robusto e distribuição de ilhotas. Fixo de Ilhéus é resuspended em gel de agarose histológica quente e pipetado em um disco plano em uma corrediça de vidro padrão, tal que os ilhéus são distribuídos em um avião. Após desidratação padrão e incorporando, seções múltiplas (10 +) 4-5 µm podem ser cortadas do mesmo bloco ilhéu. Usando esse método, análises histológicas e imunofluorescência podem ser executadas em rato, rato e ilhotas humanas. Esta é uma abordagem eficaz, barata, economia de tempo para avaliar resultados de célula tipo-específicas, intacto-arquitetura de ilhotas culturas.

Uma esquema ilustrada das etapas para preparar o gel de disco é mostrada na Figura 1. Este gel de disco método resulta em cortes de parafina que contêm um número suficiente de ilhotas distribuídas em um único plano para permitir significativa quantificação dos resultados. A Figura 2 mostra imagens de baixo-ampliação das seções resultantes para ilustrar o número de ilhotas capturado por seção. Em geral, > 35 Ilhéus...

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Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Ex vivo estudos de ilhotas pancreáticas são importantes para a pesquisa da diabetes. Técnicas existentes para estudar ilhotas cultivadas em sua arquitetura nativa 3-dimensional são demorados, ineficientes e raramente usado. Este trabalho descreve um método novo, simples e eficiente para a geração de cortes de parafina de alta qualidade de todo cultos Ilhéus.

Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

pancreatic-islet-embedding-for-paraffin-sections

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K visualizações.  UMass Medical School. Ex vivo estudos de ilhotas pancreáticas são importantes para a pesquisa da diabetes. Técnicas existentes para estudar ilhotas cultivadas em sua arquitetura nativa 3-dimensional são demorados, ineficientes e raramente usado. Este trabalho descreve um método novo, simples e eficiente para a geração de cortes de parafina de alta qualidade de todo cultos Ilhéus.

Vídeo: Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

Protocolo de Coleta para Pâncreas Humano

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Medicina

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Protocolos de coloração de ilhotas pancreáticas humanas

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Biologia do Desenvolvimento

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Imagens 3D de alta resolução da rede Neuro-insular pâncreas humano

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

Bioengenharia

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial companies have devised complex section transfer systems using fluid water. To simplify this technology, we created a simple method using homemade equipment that combines cutting and floating within a simple thermostatic chamber; therefore, the sections automatically enter the water bath on the water surface. The hippocampus from adult mouse brains, adult mouse kidneys, embryonic mouse brains, and adult zebrafish eyes were cut using both conventional paraffin sectioning and the presented method for comparison. Statistical analysis shows that our improved method saved time and produced higher quality sections. In addition, paraffin sectioning of a whole specimen in a short time is easy for junior operators.

Here, we present a protocol to improve paraffin sectioning. This method combines cutting and floating using a simple thermostatic chamber to avoid the transfer process required by the conventional method. As a result, the efficiency and the number of intact paraffin sections were greatly improved.

O corte e o método flutuante para tecido parafina para seccionamento

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

Neurociência

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Imunologia e Infecção

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

Visualização de complexos de Mitophagy endógenos in situ em células beta pancreáticas humanas utilizando o ensaio de ligadura de proximidade

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Induzindo lesão pancreática em camundongos por meio de injeção intraperitoneal de drogas

Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological changes associated with SAP using animal models can aid in identifying potential therapeutic targets and exploring novel treatment approaches. Previous studies primarily induced pancreatic injury through retrograde bile duct injection of sodium taviaurocholate, but the impact of surgical damage on the quality of the animal model remains unclear. In this study, we employed various frequencies of intraperitoneal Caerulein injections combined with different doses of LPS to induce pancreatic injury in C57BL/6J mice and compared the extent of injury across five intraperitoneal injection protocols. Regarding inducing acute pancreatitis in mice, an intraperitoneal injection protocol is proposed that results in a mortality rate as high as 80% within 5 days. Specifically, mice received ten daily intraperitoneal injections of Caerulein (50 &#181;g/kg), followed by an injection of LPS (15 mg/kg) one hour after the last Caerulein administration. By adjusting the frequency and dosage of injected medications, one can manipulate the severity of pancreatic injury effectively. This model exhibits strong controllability and has a short replication cycle, making it feasible for completion by a single researcher without requiring expensive equipment. It conveniently and accurately simulates key disease characteristics observed in human SAP while demonstrating a high degree of reproducibility.

Autor em destaque: Identificando os alvos terapêuticos para o desenvolvimento de novos tratamentos para pancreatite aguda grave em camundongos

Intraperitoneal drug administration is a safe and effective non-invasive approach for inducing pancreatic injury. This study compared five distinct intraperitoneal injection protocols on mice to induce varying degrees of pancreatic injury and established a model of severe pancreatic injury to investigate the pathological changes and treatment strategies for severe acute pancreatitis (SAP).

Preparando um modelo de camundongos de pancreatite aguda grave por meio de uma combinação de injeção intraperitoneal de ceruleína e lipopolissacarídeo

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological ...

Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Resumo

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Preparando um modelo de camundongos de pancreatite aguda grave por meio de uma combinação de injeção intraperitoneal de ceruleína e lipopolissacarídeo