Esta pesquisa é apoiada pela National Science Foundation concedido para JOD (OCE-0623475), SPC (OCE-0623534 e 0727544), e JHC (OCE-0727587 e 0623508-OCE), e pelo Office of Naval Research concedido a JHC ( N000140810654). KK é apoiada pelo Programa de Pós-Doutorado Acadêmico em Woods Hole Oceanographic Institution, com financiamento concedido pela Fundação Devonshire.

<ol><li> Para iniciar este procedimento, podemos garantir que todos os componentes SCUVA têm bateria suficiente, a fita de gravação (para a alta definição ou câmera de vídeo HD), e funcionar adequadamente. Dependendo do fluxo a ser medido, selecione a resolução de vídeo da câmera e taxas de quadros que produzem melhores resultados para a velocimetria de partículas digitais de imagem (DPIV) 1,2. </li><li> Prepare as caixas de laser e câmera para uso com a limpeza dos sulcos o-ring e o-rings com uma toalha limpa ou limpe. Fabricante espalhou desde o-ring graxa uniformemente sobre a o-rings e substituí-los nos sulcos habitação. Além disso, limpe as aberturas de habitação a laser e câmera para evitar a deformação do laser de chapas e marcas na lente da câmera de habitação. </li><li> Verifique as vedações o-ring, colocando ambas as caixas vazias em uma banheira cheia de água. Objetos ponderado terá de ser colocada em cima das caixas para submergir-los desde as caixas flutuam quando vazio. Após 5 a 10 minutos, retire as caixas da banheira e t toalha secaele fora. Verificar se há alguma humidade no interior dos alojamentos. Também considerar o uso de descartáveis, tiras de papel de umidade durante o teste de pressão para indicar a existência de humidade nas caixas após o teste. </li><li> Após as caixas passar no teste de pressão, colocar componentes dentro do SCUVA caixas. </li><li> Attach de alta intensidade de descarga (HID) pods luz para o caixa da câmera. Garantir que as luzes são orientados de tal forma que iluminam a área diretamente à frente da câmera e operador, e não interferem com a manutenção da aderência em alças e operação de controles da câmera. </li><li> Em um ambiente de pouca luz, garantir que o feixe de laser é alinhado em relação à lente óptica instalada na habitação laser. Quando devidamente alinhados, a combinação laser / lente vai criar uma folha vertical da luz que é orientado perpendicular à carcaça da câmera. Por segurança, use uma folha sensível à temperatura de papel para determinar a laser orientação da folha. </li&gt; <li> Usando anexos SCUVA eo braço rígido, prorrogável, conecte a carcaça do laser e da caixa da câmera para o outro. Garantir que as caixas são solidamente presas e que as caixas não pode girar com relação ao outro. É fundamental que a folha de laser permanece orientadas perpendicularmente ao campo da câmera de vista em toda a medição. </li><li> Devido à capacidade atual de SCUVA, mergulhos medição só pode ser realizado em locais com pouca luz ou à noite para evitar a interferência de luz natural com a folha de laser. Portanto, recomendamos que aguarde até o anoitecer ou mais tarde, antes de entrar na água. </li><li> Ligue a caixa da câmera antes de entrar na água. A caixa da câmera tem um sensor de umidade eletrônico que fornece avisos visuais (luzes LED) em caso de umidade na caixa da câmera. O sensor funciona somente quando a caixa da câmera está ligada. </li><li> SCUVA mergulhe na água e coloque o aparelho para si mesmo usandouma linha. Uma vez conectado ao aparelho, solte SCUVA para determinar as características de flutuabilidade do dispositivo. Dependendo das características de flutuabilidade, anexar espuma flutuação ou pesos de chumbo para uma ou ambas carcaças para garantir flutuabilidade neutra e evitar a rotação do aparelho em água. </li><li> Em seguida, ligue o laser e manter o aparelho fixo. Posição o laser usando o braço extensível suficientemente longe do mergulhador para minimizar a medição de fluxos de diver-induzida. Quaisquer medições de mergulhador induzida fluxos perto do alvo introduzir um erro e não são utilizados para análise posterior. Ajustar o zoom da câmera até que o campo de quadros ver o alvo e fluido circundante. </li><li> , Mantendo o aparelho parado, o foco da câmera de vídeo na folha de laser até que as partículas aparecem nítidas e em foco. Assim que o avião folha de laser está em foco, mudar a câmera para o modo de foco manual. Isso vai evitar que a câmera reorientando-a para todos os objetos que aparecem no campo devista durante a medição, resultando em partículas turva na folha de laser. </li><li> Para calibrar SCUVA, coloque um objeto com dimensões conhecidas na folha de laser dentro de campo a câmera de vídeo de vista. Gravar durante vários segundos. Após o mergulho, uma imagem será extraído a partir desta seqüência de vídeo para determinar uma constante de calibração que converte o campo de ver tamanho das unidades de pixels para cm. Se a qualquer momento o operador ajusta o campo de tamanho opinião, ser re-posição do braço extensível ou alterar o zoom da câmera durante o mergulho, as etapas 12 e 13 terão de ser repetidos. </li><li> Começar o mergulho descendo até a profundidade de trabalho. Ao encontrar um alvo, as propriedades de fluxo em massa ambientais precisam ser determinados. Se presente, a actual direcção vai ditar aparelhos e posicionamento mergulhador em relação ao alvo durante as medições. A direção do fluxo em massa ao redor do alvo pode ser inferido pela observação bolhas exalado do mergulhador e observando o seu movimento lateral. EmAlém de bolhas, uma pequena quantidade de corante fluorescente (ie, fluoresceína) pode ser liberado para determinar a direção atual. Desde mergulhador gerado fluxo pode ser uma fonte de DPIV erro de medição, o mergulhador não deve ser localizada a montante do alvo. Além disso, a folha do laser deve ser posicionado paralelamente à direção da corrente de forma a maximizar o tempo de residência dentro das partículas da folha de laser, minimizando erros DPIV. No entanto, se não houver fluxo de corrente ou a granel está presente, mergulhador e SCUVA posicionamento em relação ao alvo são irrestritas. </li><li> Posição SCUVA para iluminar e registrar o movimento fluido em torno de um alvo. Se tentar gravar o fluxo em torno de um alvo móvel primeira prever a localização do alvo, e então SCUVA posição para o local previsto, permanecendo imóvel. Como o alvo se move através do campo da câmera de vista, iniciar a gravação. Se o destino for imóvel, enquadrar o alvo e fluido que envolve na câmera de vídeo e# X2019; s campo de visão e começar a gravar, permanecendo imóvel. O operador deve abster-se de movimentos de rotação e fora do plano, durante a gravação de vídeo uma vez que estes resultam movimentos em resultados errôneos DPIV. Portanto, medidas coletadas durante a rotação e out-of-avião movimentos mergulhador não será usado para análise de dados adicionais. </li><li> Uma vez coleção de vídeos está completa, desligue todos os componentes do SCUVA e restaurar o braço laser para sua posição retraída. Remover SCUVA da água e retire a câmera e caixas de laser do braço. Lave ou mergulhe o aparelho em água doce antes da secagem para prevenir a ferrugem do aparelho. Uma vez que as caixas são secas, retire os componentes da caixas, e recarregar as baterias e substituir se for necessário para outro mergulho. </li><li> Conectar a câmera de vídeo a um computador e extrair vídeo da fita HD usando um pacote de software de vídeo HD (ou seja, Adobe Premiere Pro ou o iMovie). Depois que o vídeo é extraído, determinar o intervalo devídeo a ser convertido em uma série de imagens para análise DPIV. Garantir que as proporções de pixel e tamanhos de imagem extraída coincidir com as configurações de vídeo HD. </li><li> Estas imagens são importadas para um programa de processamento DPIV (ie, Davis ou MatPIV). Após a seleção adequada da constante de calibração e parâmetros de captura de imagem, que é solicitado a partir do pacote de software DPIV, campos de velocidade podem ser gerados a partir de imagens de partículas consecutivos. Adicional de pós-processamento passos, dependendo da qualidade e tipos de medições, também pode ser aplicado. 3 </li></ol> Resultados representativos: Quando o protocolo é feito corretamente, as imagens de partículas em torno do alvo serão nítidas e fáceis de distinguir. Utilizando os campos de partículas capturadas in situ pela câmera de vídeo SCUVA (Figura 1A) e um pacote de software de processamento de DPIV, campos de velocidade do fluxo em torno do alvo (Figura 1B) será revelado. Vetores na velocidaty campo indicam magnitude e direção da velocidade do fluxo local. Se o vídeo é coletada suficientes para fornecer uma série temporal de imagens, uma série temporal de campos de velocidade também pode ser determinado. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 Medido em campos de partículas in situ (A) em torno de Aurelia labiata. Campo de velocidade correspondente (B) com vetores amarelo indicando a direção de fluxo e magnitude. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2 Em campos de partículas em torno situ Mastigias sp. Solmissus e sp. (A e B, respectivamente). A seta vermelha indica em uma região de alta refletividade, que resulta em saturação da imagem, tornando-se difícil distinguir entre as partículas eo alvo. Seta vermelha em B indica uma região de estrias que resulta quando a vazão énão amostrados a uma freqüência alta o suficiente.

<ol>
	<li>Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-imaging+techniques+for+experimental+fluid+mechanics.">Particle-imaging techniques for experimental fluid mechanics.</a> Ann. Rev. Fluid Mech. 23, 261-304 (1991).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Exp. Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Raffel, M., Willert, C., Wereley, S., Kompenhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry: A Practical Guide. , (2007).</li><li>Agrawal, Y. C., Pottsmith, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+diffraction+particle+sizing+in+STRESS.">Laser diffraction particle sizing in STRESS.</a> Cont. Shelf Res. 14, 1101-1121 (1994).</li><li>Katz, J., Donaghay, P. L., Zhang, J., King, S., Russell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submersible+holocamera+for+detection+of+particle+characteristics+and+motions+in+the+ocean.">Submersible holocamera for detection of particle characteristics and motions in the ocean.</a> Deep Sea Res. 46, 1455-1481 (1999).</li><li>Katija, K., Dabiri, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+field+measurements+of+aquatic+animal-fluid+interactions+using+a+self-contained+underwater+velocimetry+apparatus+(SCUVA).">In situ field measurements of aquatic animal-fluid interactions using a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA).</a> Limnol. Oceanogr.-Meth. 6, 162-171 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma restrição de potenciais no campo é a necessidade de partículas no fluxo, que são necessárias para implementar velocimetria de imagens digitais de partículas (DPIV). Em águas costeiras, partículas em suspensão apresenta tamanhos da ordem de 10 m de diâmetro e concentrações entre 0,002 e 10 por mm 3. 4 estudos adicionais usando um holocamera submersível para a detecção de partículas confirmar presença suficiente de semear partículas para realizar DPIV na água do oceano. 5 Durante mar aberto e mergulho oceano costeiro, descobrimos que densidades de partículas e tamanhos não são uma restrição para a realização in situ DPIV. Além de densidades de partículas e tamanhos, outra preocupação relevante para medições DPIV é a homogeneidade das concentrações de partículas. Qualitativamente, se uma região dentro de uma janela de interrogatório tem maiores concentrações de partículas do que outra, a magnitude da velocidade gerada pelo DAnálise PIV será feito em direção a região com maiores concentrações de partículas. Portanto, as medidas SCUVA deve ser conduzido onde a variabilidade de concentração de partículas é minimizado. Encontramos concentrações thatcle são relativamente constante durante as concentrações de partículas são relativamente constantes durante os mergulhos, onde o mergulhador está suspenso no meio da coluna de água. No entanto, os campos de partículas em ambientes bentônicos têm o potencial de heterogeneidade devido à ressuspensão de partículas pela legislação ambiental ou mergulhador induzida fluxos próximo ao fundo do mar. Cuidados devem ser tomados para minimizar a interrupção das partículas durante as medições em ambientes bentônicos. Ao conhecimento dos autores, uma análise formal de erros gerados por campos de concentração não homogênea de partículas não foi realizado em condições tanto de laboratório ou de campo, e deve ser um assunto para uma análise mais aprofundada em uma publicação separada. Várias questões diferentes devem ser considerados na preparação erealização de experimentos in situ utilizando o protocolo. Durante a gravação, o operador é instruído a permanecer estacionária e abster-se de todos os out-of-plano eo movimento de rotação. Este pedido é simples na teoria, mas difícil na prática, e estas medidas requerem habilidades de mergulho avançado para ser concluída com êxito. Fora do plano e os movimentos de rotação do resultado operador em dados errados DPIV. No entanto, no plano movimentos podem ser corrigidas usando in-house software. 6 Recomenda-se o operador para a prática de controle de flutuabilidade para vários mergulhos antes de utilizar o SCUVA para maximizar a eficiência de medição. Além de considerações de flutuabilidade, o operador deve estar ciente da direção do fluxo alvo. Fluxos que viajam fora do plano-em relação à folha de laser não irá produzir resultados confiáveis ​​DPIV, eo operador deve orientar SCUVA para captar esses fluxos de forma mais eficaz. Além disso, a posição do mergulhador em relação ao alvo deve ser selected modo a minimizar mergulhador induzida por fluxo nas medições. Diver-induzida do fluxo apresenta erro para o fluxo de destino e medidas que incluem efeitos de mergulhador não deve ser usado para análise posterior. No caso em que o alvo tem uma superfície altamente reflexiva, a região fluido que envolve o alvo será fortemente iluminado, tornando-se difícil distinguir nas proximidades partículas individuais do fluido circundante (região indicada pela seta vermelha, Figura 2A). Filtros ou polarizadores podem ser adicionados para as caixas de laser ou câmara para reduzir a intensidade da luz do laser capturada pelo sensor da câmera de vídeo. Se isso não for possível devido a limitações logísticas e de acesso limitado a equipamentos, pós-processamento de imagens usando in-house software pode proporcionar a correção suficiente subtraindo-se a partir das imagens da intensidade dos pixels elevado perto do alvo. Outra consideração que afeta a qualidade de dados é DPIV se estrias de partículas estão presentes. Se partículascampos têm regiões de estrias (indicado por seta vermelha, Figura 2B), a câmera de vídeo é a gravação em um frame rate muito baixo para resolver estas altas velocidades. Ao aumentar a taxa de quadros, estrias partícula pode ser reduzida. No entanto, isso resulta em uma redução de luz que chega ao sensor da câmera de vídeo e faz com que a partícula dimmer olhar campo. Se a câmera de vídeo tem a capacidade de definir manualmente as configurações de abertura, aumentar o ajuste de abertura para evitar escurecimento do campo de partículas. Determinar as configurações do dispositivo ideal pode exigir múltiplos mergulhos com SCUVA antes da coleta de dados bem sucedida.

quantitatively measuring in situ flows using a self-contained underwater velocimetry apparatus (scuva)

A capacidade de medir diretamente a campos de velocidade em um ambiente fluido é necessário fornecer dados empíricos para estudos em áreas tão diversas como a oceanografia, ecologia, biologia e mecânica dos fluidos. Medições de campo introduzir desafios práticos tais como condições ambientais, a disponibilidade de animais, ea necessidade de técnicas de campo compatível com a medição. Para evitar esses desafios, os cientistas normalmente usam ambientes controlados de laboratório para o estudo animal-fluido interações. No entanto, é razoável questionar se é possível extrapolar o comportamento natural (isto é, o que ocorre no campo) a partir de medições em laboratório. Portanto, in situ medições de fluxo quantitativa são necessários para descrever com precisão natação animal em seu ambiente natural. Nós projetamos uma auto-contido dispositivo portátil, que funciona independente de qualquer ligação com a superfície, e pode fornecer medições quantitativas dos surrou campo de fluxonding um animal. Este aparelho, um equipamento autônomo de velocimetria subaquática (SCUVA), pode ser operado por um mergulhador única em profundidades de até 40 m. Devido à complexidade inerente de condições de campo, considerações adicionais e preparação são necessárias quando comparado com medidas laboratoriais. Estas considerações incluem, mas não estão limitados a, o movimento do operador, a previsão das posições dos alvos de natação, de partículas naturais disponíveis suspenso, e orientação de SCUVA em relação ao fluxo de interesse. O protocolo a seguir destina-se para enfrentar esses desafios campo em comum e para maximizar o sucesso de medição.

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Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

Este protocolo fornece instruções sobre como usar um equipamento autônomo de velocimetria subaquática (SCUVA), que é projetado para a quantificação in situ de animais gerados fluxos. Além disso, este protocolo aborda os desafios colocados pelas condições de campo, e inclui o movimento do operador, prevendo posição de animais, e orientação de SCUVA.

Medir quantitativamente In situ Fluxos usando um Aparelho Autônomo de Velocimetria Underwater (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

quantitatively-measuring-situ-flows-using-self-contained-underwater

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

12.9K visualizações.  Woods Hole Oceanographic Institution. Este protocolo fornece instruções sobre como usar um equipamento autônomo de velocimetria subaquática (SCUVA), que é projetado para a quantificação in situ de animais gerados fluxos. Além disso, este protocolo aborda os desafios colocados pelas condições de campo, e inclui o movimento do operador, prevendo posição de animais, e orientação de SCUVA.

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Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Fundamentos eletrofiação: Solução de Otimização e Parâmetros Aparelho

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Bioengenharia

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-partículas Velocimetry Imagem para a velocidade Medidas de fluxos de sangue Micro Perfil

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM de Assembleias Biológicas em Líquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

Customizado aparelho de aquecimento à base de laser para lançamento acionado de cisplatina de termossensível lipossomas com Ressonância Magnética Orientação Imagem

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

Aparelhos para colheita de tecido Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows across a large spatiotemporal range. However, its implementation typically requires the use of expensive and specialized instrumentation, which limits its broader utility. Moreover, within the field of bioengineering, in vitro flow visualization studies are also often further limited by the high cost of commercially sourced tissue phantoms that recapitulate desired anatomical structures, particularly for those that span the mesoscale regime (i.e., submillimeter to millimeter length scales). Herein, we present a simplified experimental protocol developed to address these limitations, the key elements of which include 1) a relatively low-cost method for fabricating mesoscale tissue phantoms using 3-D printing and silicone casting, and 2) an open-source image analysis and processing framework that reduces the demand upon the instrumentation for measuring mesoscale flows (i.e., velocities up to tens of millimeters/second). Collectively, this lowers the barrier to entry for nonexperts, by leveraging resources already at the disposal of many bioengineering researchers. We demonstratethe applicability of this protocol within the context of neurovascular flow characterization; however, it is expected to be relevant to a broader range of mesoscale applications in bioengineering and beyond.

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Here we present simplified methods for fabricating transparent neurovascular phantoms and characterizing the flow therein. We highlight several important parameters and demonstrate their relationship to field accuracy.

Meso-escala Particle Image Velocimetry estudos de Neurovascular flui em Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...