Gostaríamos de agradecer ao Dr. Paul Weigel na Univ. de Oklahoma para o uso de anticorpo monoclonal para a detecção de 30 do receptor HARE/Stabilin-2 Weigel e Janet pela sua assistência técnica. Esta pesquisa é financiada pela Universidade de Fundos de Pesquisa Nebraska.

1. Excisão do fígado (adotada a partir de 12 e PO Seglen Blomhoff R. 13 com modificações 14,15) <ol><li> Adicionar 10 mL de 30% de isoflurano em polietileno glicol a uma placa de petri em uma câmara fechada L 5.5. É ideal para esperar 10-15 min após a adição de isoflurano para criar um ambiente estabilizado dentro da câmara. </li><li> Coloque um rato na câmara selada e permitir que ele se torne anestesiados. Plenos efeitos da anestesia são visíveis quando o animal torna-se flácido, sem resposta, e apresenta respiração profunda. </li><li> Coloque 2 mL de isoflurano em polietileno glicol em algumas bolas de algodão na parte inferior de um tubo de seringa 30 mL. </li><li> Coloque o rato sobre as suas costas em uma bandeja coberta de fralda e colocar o tubo da seringa sobre o focinho. </li><li> Confirmar imediatamente anestesia profunda molhando o abdômen com etanol 70%. Não deixe que o animal morrer por overdose isoflurano. </li><li> Usando uma tesoura curativo e fórceps, expor o abd todacavidade ominal. </li><li> Localize a porta da veia e, usando uma pinça, desenhe duas fitas de seda ou de fio de poliéster cirúrgica (ligadura) abaixo da veia porta imediatamente acima do ramo mesentérico. </li><li> Retirar a pinça e faça um nó overhand solta. </li><li> Utilizando uma pinça debaixo da porta cava e puxando de volta para endireitar a veia, canular a veia com cateter autoguard INSYTE (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) cateter ou similar. O cateter deve ir além dos vários milímetros laço formado pelo segmento. </li><li> Retrair e remover a agulha, liberando o gatilho de mola sobre o cateter. Sangue deve começar a escorrer para dentro do cateter indicando colocação de ligadura adequada. </li><li> Apertar o nó overhand e fixe-a com outro nó. </li><li> Sever ou a veia cava ou aorta descendente (aorta abdominalis) para permitir que o sangue escorra do sistema circulatório. </li><li> Comece a lavar o fígado com oxigenadaTBS, a 37 ° C para remover o sangue (branqueamento) a uma vazão de 20 mL / min. O fígado deve girar de um roxo-avermelhado para uma cor de barro. </li><li> Enquanto o fígado está esvaziando especiais de consumo, o fígado cortando-se o trato gastrointestinal e do tecido conjuntivo. É importante não lacerar o fígado ou perfure a cápsula de Glisson. </li><li> Coloque o fígado de uma rede de plástico sobre um funil que permite buffers a serem recolhidos e recirculado. Buffers, neste ponto não deve ser recirculado, mas o fluxo para o copo de resíduos. Lavagem não deve durar mais de 10 min. (Fig. 2A). Prepare a solução endocitose requeridas no ponto 2.1 passo. </li></ol> 2. Internalização de 125 I-SA-b-Hep (ou ligante adequado outros rotulados) <ol><li> A 50 mL de mídia RPMI em um pequeno copo, adicionar a uma concentração final BSA 0,05% e 0,01 mCi 125 I-SA-b-Hep ou ligante devidamente rotulados para outros endocitose. </li><li> Anexar esse copo ao apparatus para permitir a oxigenação. </li><li> Desligar a bomba, mude a tubulação de entrada, e depois ligar a bomba a 20 mL / min. </li><li> Como o RPMI rotulados abordagens do fígado, desligue a bomba e permitir que o excesso de líquido no funil de drenagem e tubulação. </li><li> Coloque a tubulação de dreno para o copo de mídia para permitir a recirculação da mídia rotulados e reinicie a bomba. </li><li> Permitir que fluidos para recircular através do fígado por não mais de uma hora. </li><li> Durante esta etapa de internalização, certifique-se que a temperatura no fígado é estável, cobrindo-o e preparar a colagenase para a digestão. </li></ol> 3. Digestão do fígado pela digestão da colagenase <ol><li> Recém-dissolvido e filtrada (0,45 mm) colagenase (100 de peso de ratos mg / kg) deve ser adicionado ao tampão de dois em um volume total não deve exceder 60 ml a 37 ° C. O volume é dependente do comprimento / volume interno da tubulação e deverá ser ajustado em conformidade. </li><li> Pare a bomba e trocar otubulação de entrada do copo de mídia para a TBS. </li><li> Lave o fígado por 2 min a 50 mL / min, que permite o afrouxamento das junções celulares desmossomais que são dependentes de cálcio. </li><li> Enquanto o fígado é o rubor, a troca do copo de mídia com o copo contendo colagenase sobre o aparelho. </li><li> Imediatamente após a lavagem, começar a digestão com colagenase em um loop circulatório a uma vazão de 20 mL / min até 15 min. Desde lotes colagenase variam de acordo com número de lote, as variações na quantidade e tempo de digestão precisam ser otimizados para cada novo lote de colagenase. Colagenase também é dependente de cálcio. Desligar a bomba e trocar o buffer e linhas de gás do balão A para B. Flask transferência da linha de efluente do recipiente de resíduos para Flask B (Fig. 2B). </li><li> Parar a bomba, remover o cateter e transferir o fígado para um prato contendo 20-30 mL de buffer 1. </li><li> Retire a cápsula de Glisson do fígado e agitar o celulars no líquido. </li><li> À medida que o líquido se torna opaco com material celular, transferência de células através de uma malha M 100 seguido por filtração através de uma malha M 30 e, em seguida, em um 50 mL cônico no gelo. </li><li> Adicionar mais um buffer para o fígado e continuar balançando as células hepáticas a partir da matriz, transferindo o líquido para os filtros de malha e cônico. </li><li> Repita os passos de 3,7-3,9 até que não haja mais células pode ser desalojado com agitação razoável do fígado. </li></ol> 4. Purificação dos hepatócitos e SEC <ol><li> Centrífuga de 50 mL contendo células conicals a 150 xg por 3 min. pellet para os hepatócitos. </li><li> Alienar a fração líquida contendo células não-parenquimatosas a fresco 50 mL conicals no gelo. </li><li> Lavar os hepatócitos ser ressuspender o sedimento em tampão 3 e repetindo os passos 4.1 e 4.2 mais três vezes. </li><li> No final da lava, as pelotas são ≥ 97% hepatócitos puro. Para obter a SCEE, centrifugar todos os tubos containing pooled sobrenadante (contendo HSCs, SECS, e KCs e alguns hepatócitos pequenos) a 200 xg por 10 min. a 4 ° C. </li><li> Aspirar o buffer e ressuspender todos os pellets em 5 mL RPMI / BSA a 4 ° C. </li><li> Piscina as células juntas em 2 tubos e adicionar RPMI / BSA até um volume de 35 mL. </li><li> Centrifugar a 100 xg conicals por 3 min. </li><li> Recolher o top 25 mL de líquido e transferir para um limpo 50 ml. </li><li> Ressuspender o sedimento em media os restantes 10 mL e adicionar novamente 25 mL de frio RPMI / BSA e centrifugar a 100 xg por 3 min. </li><li> Repita os passos 3.8 e 3.9, uma vez mais, descartar o pellet celular e menor media 10 mL. </li><li> Centrifugar a supernatents para pellet SCEE, KCs e HSCs a 200 xg por 10 min. a 4 ° C. </li><li> Preparar três tubos de 50 mL contendo 20 mL de Percoll 25% em PBS sobre o gelo. Underlay com 15 mL de Percoll 50% em cada tubo. </li><li> Ressuspender o pellets de células em um volume total de 30 mL RPMI / BSA. </li><li> Cuidadosamente overlay each gradiente com 10 mL de células e centrifugação a 900 xg por 20 min a 4 ° C. </li><li> SCEE e KCs têm muito perto densidade de flutuação e estão na interface 25/50%. HSCs são tipicamente menos os 25% / media de interface devido à sua maior flutuabilidade como células lipídicas armazenamento. Qualquer hepatócitos remanescentes e as células sanguíneas têm a menor e são buoyancies peletizada. Aspirar de cima para baixo perto da interface 25/50% e descartar este material. </li><li> Coletar as células na interface de 25/50% e transferir para um cônico fresco com RPMI frio. O volume final deve ser ~ 40 mL para diluir o Percoll. </li><li> Centrifugar a cônica em 350 xg por 10 min a 4 ° C para agregar as células. </li><li> Ressuspender as células em ~ 10 mL pré-aquecido RPMI contendo 100 U / mL Penicillin/100 células g / mL estreptomicina e coloque em um ácido lavado prato de vidro Petri ou cristalização prato. </li><li> Incubar as células por 15 min. a 37 ° C em uma incubadora de cultura de tecidos. </li><li> Rocha ou redemoinho da placa um poucoe depois recolher os SECS no sobrenadante. O KCs aderir ao vidro muito mais rapidamente do que SCEE. Alternativamente, SCEE pode ser separado por KCs immunopurification utilizando anticorpos anti-CD31 ou anti-Stabilin2/HARE conjugado com esferas magnéticas. </li><li> Números e viabilidade celular pode ser avaliado pela exclusão do azul tripan utilizando um hemocitômetro ou com o uso de um contador de células automatizado. </li><li> Cultura da SCEE em fibronectina revestido pratos de plástico, a 37 ° C, 5% CO 2, BSA RPMI/0.25% com 40 ng / mL VEGF, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / mL ou com hepatócitos media condicionado. </li><li> Hepatócitos, KCs e SCEE pode ser avaliar para a internalização do material marcado pelo uso de um contador gama e normalizar a proteína celular total ou por microscopia (se fluorescente etiquetado) com estes métodos de cultivo. </li></ol> 5. Resultados representativos: Purificação dos hepatócitos é ≥ 97% e purificação SEC é typicaliado ≥ 95% usando este método. Excisão da cavidade abdominal, canulação da veia porta, e branqueamento do fígado todos devem ocorrer dentro de um minuto para obter os melhores resultados. HARE/Stabilin-2 é um receptor específico na SCEE fígado e não é expressa em outros tipos de células do fígado. Nesta amostra, lisados ​​celulares de ambos os hepatócitos e SCEE foram separados em 5% SDS-PAGE e sondou com um anticorpo monoclonal contra ambas as isoformas da Stabilin-2 (Fig. 3). Heparina não fracionada injetada na corrente sanguínea é eliminado pelo fígado 16. Depuração é realizada principalmente pela SCEE fígado, em contraste com hepatócitos e KCs 17. O receptor Stabilin-2/HARE é o receptor que se liga clearance principal e internaliza heparina em SCEE 18. No nosso exemplo aqui, nós rotulados heparina com uma tag biotina sobre o grupo carboxilato de GlcNAc / NS. A biotina foi conjugado com estreptavidina iodado para a detecção de prot heparina internalizadoeoglycan. Injeção de heparina marcada seguido por exsangüinação 30 minutos após a injecção nos permite monitorar os órgãos internalizar esta forma de heparina. Neste curto intervalo de tempo, o fígado é o órgão de folga primário (Fig. 4). Para compreender mais claramente que tipo de célula é responsável pela depuração, acrescentamos 125 I-SA-b-Hep à mídia RPMI suplementado com BSA 0,05% e permitiu que a circular através do fígado por 20 min. Após digestão com colagenase e purificação celular, a grande maioria de heparina marcada é internalizada pela SECS, em contraste com hepatócitos (Fig. 5). <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Fígado arquitetura Basic. SCEE formam as paredes dos sinusóides e são normalmente fenestrado (pequenos grupos de círculos). Células estreladas (HSCs) são encontrados no espaço de Disse, em contraste com Kupffer cells (KCS), que estão normalmente presentes na microcirculação dos sinusóides. Hepatócitos ocupar o outro lado do espaço de Disse. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Esquemática do aparelho de perfusão. A) Set-up do aparelho durante a lavagem / lavagem dos sinusóides do fígado. TBS está num frasco de 1 L. B) Um frasco contendo 125 mL a 60 mL de buffer 2 com colagenase é utilizada para a digestão do fígado em um circuito fechado. A linha de efluentes também é alterada a partir do recipiente de resíduos de frasco B através de um corte entalhe na tampa de borracha. A linha de oxigênio não é submerso no buffer contendo colagenase (B frasco) para evitar a formação de espuma. As rolhas em cada frasco são entalhados para permitir a transferência eficiente da linha de efluentes e para evitar aumento da pressão do gás oxigênio. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. </spreparações trong&gt; Hepatócito não estão contaminados com SCEE. Quantidades iguais de lisados ​​celulares de lotes purificada dos hepatócitos (pista 1) e SECS (pista 2) foram separados em 5% SDS-PAGE e apagou a nitrocelulose. Anticorpo monoclonal # 30, que é específica contra ambas as isoformas (315 kDa e 190 kDa) de HARE/Stabilin-2 foi usado para investigar o lisados. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Distribuição de heparina rotulados de órgãos. Ratos foram injetados através da veia caudal lateral com 125 wait I-SA-b-hep por 30 minutos e depois sangrar. O sangue foi coletado de forma a não dar quaisquer órgãos artificialmente leituras elevadas. Contagens por minuto (CPM) de cada órgão foram normalizados contra o peso do órgão em gramas. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Quantidade de heparina rotulado em hepatócitos e SCEE. RPMEu mídia contendo 125 I-SA-b-Hep foi autorizado a circular através de um fígado intacto por 20 min seguida de digestão da colagenase e purificação celular. Quantidades iguais de hepatócitos e SEC lisados ​​proteínas celulares foram quantificados com o Ensaio de Bradford e contados por um contador gama. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6 células. Kupffer estão separados SECS pela adesão em vidro. As células foram colocadas em um prato de vidro lavado com ácido e cristalização e permitiu a aderir por 15 min a 37 ° C, 5% CO 2. O sobrenadante contendo células não-aderidas foi agitado suavemente e colocado em um tubo de centrifugação. Lisados ​​de ambas as células aderidas em vidro (pista 1) e de células não-aderidas (pista 2) foram separados em 8% SDS-PAGE, apagado, e sondou com um anticorpo contra a CD163, que é específico para células de Kupffer. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. SECS plaqueadas em plástico revestido fibronectina 6-bem pratos foram incubadas durante a noite em RPMI suplementado com BSA 0,1%. Imagens de contraste de fase foram tomadas a (A) 100x e (B) ampliação 200x.

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Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Anestesia do rato pelo método de gota em suspensão em que o isoflurano vapor induz a inconsciência é o método preferido para os nossos estudos. Um vaporizador também pode ser usado em vez de uma seringa com algodão para manter o animal fora da câmara, mas os procedimentos cirúrgicos são tão rápidos, não é necessário. Polietileno glicol é adicionado ao isoflurano para diminuir a pressão de vapor e taxa de evaporação. Muito vapor isoflurano vai induzir a morte muito rapidamente. Se o animal morrer antes do fígado é canulada e escaldados com TBS, o acúmulo de sangue pode formar coágulos no fígado e prevenir a lavagem eficiente dos sinusóides e digestão com colagenase. A adição de heparina pode ser útil como um anticoagulante mas não é usado nesses estudos, já que utilizamos heparina rotulados como nossa sonda. Gey solução tamponada de salina (GBSS) é muitas vezes substituído por outros laboratórios para a purificação de SCEE. Embora seja útil para a SEC purificação, hepatocytes não toleram GBSS bem como Buffers 1-3 e viabilidades não são tão altos. Ao medir a endocitose, é uma boa prática para medir os níveis de fundo no órgão e em hepatócitos purificada. Este método é um dos dois para a purificação eficiente da SCEE após a perfusão hepática com colagenase. O outro método separa as células não-parenquimatosas por centrifugação elutriação 19 em vez de gradiente de Percoll. As vantagens para a utilização de mais de elutriação gradientes de Percoll são viabilidades celulares ligeiramente maior e números. A desvantagem é que a centrifugação elutriação requer um rotor especializados, dedicados centrífuga, e bomba peristáltica juntos que custa dezenas de milhares de dólares. Este método requer apenas o uso de uma centrífuga refrigerada de bancada e uma bomba peristáltica que é padrão em muitos laboratórios. Separação de segundos e KCs por adesão seletiva é um método padrão20-22. Embora seja verdade que SCEE vai aderir ao vidro e plástico, o ponto chave é usar ácido lavou o vidro limpo, com não mais do que 15 minutos de incubação a 37 ° C em 5% CO 2. KCs sempre aderem mais rápido do que segundos e é aconselhável lavar cuidadosamente a KCs com a mídia para extrair qualquer SECS restantes que tornaram-se frouxamente ligados. Pronase e outras proteases também são omitidos os passos colagenase digestão neste protocolo para aumentar a viabilidades das células. Proteases digerir receptores extracelulares e pode inibir a adesão celular nas etapas de purificação final. O método aqui apresentado tem uma grande variedade de aplicações. Embora nós mostramos o resultado final em que a heparina é inicialmente assumido para a perfusão de apuramento, do fígado para a obtenção de hepatócitos primários, KC, SECS, e HSCs pode ser útil para uma série de estudos envolvendo vias metabólicas, imunorregulação, atividades de catadores, e outros fisiológicas studies. A parte mais difícil deste procedimento é canulação boa, a digestão do fígado, e manuseio do fígado sem ter o deslizamento cateter da veia portal.

<ul><li> Buffer 1: 142 mM NaCl 6,7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,5% BSA, pH 7,4 </li><li> Buffer de 2 (tampão de perfusão): 67,0 mM NaCl, 6,7 mM KCl, 4,8 mM CaCl 2-H2O, 101,0 mM HEPES, BSA 1,5%, pH 7.4. </li><li> Buffer de três: 137 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,7 mM MgSO 4, 1,2 mM CaCl 2 2H 2 O, 10 mM HEPES, 1,5% BSA, pH 7,4 </li><li> RPMI / SC: 15g / L BSA em RPMI </li><li> TRIS-buffered salina (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM de sal Base de Dados de Trizma. </li><li> Colagenase: colagenase A (# 11088785103) da Roche, colagenase tipo I (# LS004691) de Worthington Biochemical ou eu colagenase (# C0130) ou IA (# C9891) da Sigma-Aldrich. </li></ul> Todos os sais são da Sigma-Aldrich <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Modelo / catalogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Banho de água 20L </td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td> Água é de aproximadamente 45 ° C para compensar refrigeração </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> dentro da tubulação. </td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-70 </td><td> Masterflex série </td></tr><tr><td> Centrífuga refrigerada </td><td> Sorvall </td><td> Legenda XTR </td><td></td></tr><tr><td> Cateter </td><td> BD Biosciences </td><td> 381444 </td><td></td></tr><tr><td> Câmara exsicador </td><td> Pescador </td><td> 08595E </td><td> Use placa interna </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> SeraCare </td><td> AP-4510-01 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mesh mM </td><td> Espectro de laboratórios </td><td> 146488 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mesh mM </td><td> Espectro de laboratórios </td><td> 146506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870 </td><td></td></tr><tr><td> Polietileno glicol </td><td> Espectro de laboratórios </td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

O fígado é o centro metabólico do corpo dos mamíferos e serve como um filtro para o sangue. A arquitetura básica do fígado é ilustrado na figura 1, no qual mais de 85% da massa do fígado é composto por hepatócitos e os restantes 15% da massa celular é composta por células de Kupffer (KCS), células estreladas (HSCs), e sinusoidal células endoteliais (SCEE). SCEE formam as paredes dos vasos sanguíneos dentro do fígado e conter morfologia especializada chamada fenestras dentro do citoplasma. Fenestração do citoplasma é o aparecimento de buracos (~ 100 mm) dentro das células, para que o ato SECS como uma peneira em que a maioria quilomícrons, remanescentes de quilomícrons e macromoléculas, mas não células, passam para os hepatócitos e HSCs 1 (Fig. 1). Devido à falta de uma membrana basal, o fosso entre os segundos e hepatócitos formam o espaço de Disse. HSCs ocupar este espaço e desempenhar um papel proeminente na regulação e resposta ao injury, armazenamento de ácido retinóico e imunorregulação dos dois de fígado. SCEE estão entre as células mais ativas endocytically do corpo exibindo uma variedade de receptores scavenger em seus três superfície da célula. Estes incluem SR-A, Stabilin-1 e Stabilin-2. Geralmente, pequenas partículas coloidais menos de 230 nm e macromoléculas em fase de buffer são ocupados por SCEE, enquanto que, as partículas grandes e restos celulares é endocytosed (fagocitados) por KCs 4. Assim, a depuração maior parte do material extracelular, como os glicosaminoglicanos do sangue é em grande parte dependentes da saúde e as funções endocítica da SCEE 5,6. Por exemplo, um aumento dos níveis sanguíneos de ácido hialurônico é um indicativo de doença hepática variando de leve a formas mais graves 7. Com a exceção de um relatório de 8, não há linhas de células imortalizadas SEC na existência. Mesmo esta linha de células imortalizadas é de-diferenciadoated in que não expressam receptores scavenger que estão presentes em SECS primária (os nossos dados, não mostrados). Todos os estudos de células biológicas devem ser realizadas em células primários obtidos recentemente a partir do animal. Infelizmente, SCEE desdiferenciem sob condições de cultura padrão e deve ser utilizado dentro de 1 ou 2 dias após o isolamento do animal. Diferenciação do SCEE é marcada pela expressão de Stabilin-2 ou receptor HARE 9, CD31, ea presença de fenestração citoplasmática 1. Diferenciação do SCEE pode ser estendido com a adição de VEGF em meios de cultura ou cultura de células em meio condicionado de hepatócitos 10,11. Neste relatório, vamos demonstrar a atividade endocítica da SCEE no órgão intacto utilizando rádio-etiquetados heparina de ácido hialurônico para a SEC-receptor específico Stabilin-2. Nós, então, purificar hepatócitos e SCEE do fígado perfundido para medir a endocitose.

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In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

O estudo do fígado sinusoidal células endoteliais (SCEE) devem ser realizados com células primárias provenientes do animal como não existem linhas celulares. Este método baseia-se na digestão de fígado e centrifugação diferencial para SEC purificação para a cultura subseqüente e experimentação.

Endocitose em Fígado vivo seguidos de purificação de células do fígado por perfusão de fígado

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

in-vivo-liver-endocytosis-followed-purification-liver-cells-liver

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

19.0K visualizações.  University of Nebraska, Lincoln. O estudo do fígado sinusoidal células endoteliais (SCEE) devem ser realizados com células primárias provenientes do animal como não existem linhas celulares. Este método baseia-se na digestão de fígado e centrifugação diferencial para SEC purificação para a cultura subseqüente e experimentação.

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Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Bioquímica

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in cell-to-cell communication by shuttling bioactive molecules such as RNA or protein from one cell to another. Most studies of EVs have been performed in cell culture models or in EVs isolated from body fluids. There is emerging interest in the isolation of EVs from tissues to study their contribution to physiological processes and how they are altered in disease. The isolation of EVs with sufficient yield from tissues is technically challenging because of the need for tissue dissociation without cellular damage. This method describes a procedure for the isolation of EVs from mouse liver tissue. The method involves a two-step process starting with in situ collagenase digestion followed by differential ultra-centrifugation. Tissue perfusion using collagenase provides an advantage over mechanical cutting or homogenization of liver tissue due to its increased yield of obtained EVs. The use of this two-step process to isolate EVs from the liver will be useful for the study of tissue EVs.

This is a protocol to isolate tissue extracellular vesicles (EVs) from the liver. The protocol describes a two-step process involving collagenase perfusion followed by differential ultracentrifugation to isolate liver tissue EVs.

Isolamento de vesículas extracelulares teciduais do fígado

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Isolamento de fibroblastos de rato por Portal<em&gt; In situ</em&gt; Perfusão de fígado

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Biologia

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Imagem intraocular in vivo não invasiva de esferoides hepáticos enxertados em camundongos

In Vivo Imaging of Liver Spheroids Engrafted in the Anterior Chamber of the Mouse Eye

Biomedical studies of the liver in mammals are hindered by the lack of methods for in vivo noninvasive longitudinal imaging at cellular resolution. Until now, optical imaging of the liver in situ is possible by intravital imaging, which offers high-resolution imaging at the cellular level but cannot be performed multiple times and, therefore, longitudinally in the same animal. Noninvasive imaging methods, such as bioluminescence, allow repeated imaging sessions on the same animal but do not achieve cell resolution. To address this methodology gap, we have developed a platform for noninvasive in vivo imaging of liver spheroids engrafted in the anterior chamber of the mouse eye. In the workflow described in this study, primary mouse liver spheroids are generated in vitro and transplanted into the anterior chamber of the eye of recipient mice, where they engraft on the iris. The cornea acts as a natural body window through which we can image the engrafted spheroids by conventional confocal microscopy. The spheroids survive for months in the eye, during which the cells can be studied in contexts of health and disease, as well as being monitored in response to different stimuli over repeated imaging sessions using appropriate fluorescent probes. In this protocol, we provide a breakdown of the necessary steps to implement this imaging system and explain how to best harness its potential.

Autor em destaque: Aproveitando as câmaras oculares do camundongo para estudos não invasivos de esferóides hepáticos

Here, we describe a platform that allows noninvasive in vivo imaging of liver spheroids engrafted in the anterior chamber of the mouse eye. The workflow spans from generating spheroids from primary liver cells to transplantation into the mouse eye and in vivo imaging at cellular resolution by confocal microscopy.

Imagens in vivo de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo

Biomedical studies of the liver in mammals are hindered by the lack of methods for in vivo noninvasive longitudinal imaging at cellular resolution. Until ...

Endocitose em Fígado vivo seguidos de purificação de células do fígado por perfusão de fígado

Resumo

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Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

Isolamento de vesículas extracelulares teciduais do fígado

Isolamento de fibroblastos de rato por Portal

Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Imagens in vivo de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo

Imagens in vivo de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo