Gostaríamos de agradecer ao Dr. Paul Weigel na Univ. de Oklahoma para o uso de anticorpo monoclonal para a detecção de 30 do receptor HARE/Stabilin-2 Weigel e Janet pela sua assistência técnica. Esta pesquisa é financiada pela Universidade de Fundos de Pesquisa Nebraska.

1. Excisão do fígado (adotada a partir de 12 e PO Seglen Blomhoff R. 13 com modificações 14,15) <ol><li> Adicionar 10 mL de 30% de isoflurano em polietileno glicol a uma placa de petri em uma câmara fechada L 5.5. É ideal para esperar 10-15 min após a adição de isoflurano para criar um ambiente estabilizado dentro da câmara. </li><li> Coloque um rato na câmara selada e permitir que ele se torne anestesiados. Plenos efeitos da anestesia são visíveis quando o animal torna-se flácido, sem resposta, e apresenta respiração profunda. </li><li> Coloque 2 mL de isoflurano em polietileno glicol em algumas bolas de algodão na parte inferior de um tubo de seringa 30 mL. </li><li> Coloque o rato sobre as suas costas em uma bandeja coberta de fralda e colocar o tubo da seringa sobre o focinho. </li><li> Confirmar imediatamente anestesia profunda molhando o abdômen com etanol 70%. Não deixe que o animal morrer por overdose isoflurano. </li><li> Usando uma tesoura curativo e fórceps, expor o abd todacavidade ominal. </li><li> Localize a porta da veia e, usando uma pinça, desenhe duas fitas de seda ou de fio de poliéster cirúrgica (ligadura) abaixo da veia porta imediatamente acima do ramo mesentérico. </li><li> Retirar a pinça e faça um nó overhand solta. </li><li> Utilizando uma pinça debaixo da porta cava e puxando de volta para endireitar a veia, canular a veia com cateter autoguard INSYTE (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) cateter ou similar. O cateter deve ir além dos vários milímetros laço formado pelo segmento. </li><li> Retrair e remover a agulha, liberando o gatilho de mola sobre o cateter. Sangue deve começar a escorrer para dentro do cateter indicando colocação de ligadura adequada. </li><li> Apertar o nó overhand e fixe-a com outro nó. </li><li> Sever ou a veia cava ou aorta descendente (aorta abdominalis) para permitir que o sangue escorra do sistema circulatório. </li><li> Comece a lavar o fígado com oxigenadaTBS, a 37 ° C para remover o sangue (branqueamento) a uma vazão de 20 mL / min. O fígado deve girar de um roxo-avermelhado para uma cor de barro. </li><li> Enquanto o fígado está esvaziando especiais de consumo, o fígado cortando-se o trato gastrointestinal e do tecido conjuntivo. É importante não lacerar o fígado ou perfure a cápsula de Glisson. </li><li> Coloque o fígado de uma rede de plástico sobre um funil que permite buffers a serem recolhidos e recirculado. Buffers, neste ponto não deve ser recirculado, mas o fluxo para o copo de resíduos. Lavagem não deve durar mais de 10 min. (Fig. 2A). Prepare a solução endocitose requeridas no ponto 2.1 passo. </li></ol> 2. Internalização de 125 I-SA-b-Hep (ou ligante adequado outros rotulados) <ol><li> A 50 mL de mídia RPMI em um pequeno copo, adicionar a uma concentração final BSA 0,05% e 0,01 mCi 125 I-SA-b-Hep ou ligante devidamente rotulados para outros endocitose. </li><li> Anexar esse copo ao apparatus para permitir a oxigenação. </li><li> Desligar a bomba, mude a tubulação de entrada, e depois ligar a bomba a 20 mL / min. </li><li> Como o RPMI rotulados abordagens do fígado, desligue a bomba e permitir que o excesso de líquido no funil de drenagem e tubulação. </li><li> Coloque a tubulação de dreno para o copo de mídia para permitir a recirculação da mídia rotulados e reinicie a bomba. </li><li> Permitir que fluidos para recircular através do fígado por não mais de uma hora. </li><li> Durante esta etapa de internalização, certifique-se que a temperatura no fígado é estável, cobrindo-o e preparar a colagenase para a digestão. </li></ol> 3. Digestão do fígado pela digestão da colagenase <ol><li> Recém-dissolvido e filtrada (0,45 mm) colagenase (100 de peso de ratos mg / kg) deve ser adicionado ao tampão de dois em um volume total não deve exceder 60 ml a 37 ° C. O volume é dependente do comprimento / volume interno da tubulação e deverá ser ajustado em conformidade. </li><li> Pare a bomba e trocar otubulação de entrada do copo de mídia para a TBS. </li><li> Lave o fígado por 2 min a 50 mL / min, que permite o afrouxamento das junções celulares desmossomais que são dependentes de cálcio. </li><li> Enquanto o fígado é o rubor, a troca do copo de mídia com o copo contendo colagenase sobre o aparelho. </li><li> Imediatamente após a lavagem, começar a digestão com colagenase em um loop circulatório a uma vazão de 20 mL / min até 15 min. Desde lotes colagenase variam de acordo com número de lote, as variações na quantidade e tempo de digestão precisam ser otimizados para cada novo lote de colagenase. Colagenase também é dependente de cálcio. Desligar a bomba e trocar o buffer e linhas de gás do balão A para B. Flask transferência da linha de efluente do recipiente de resíduos para Flask B (Fig. 2B). </li><li> Parar a bomba, remover o cateter e transferir o fígado para um prato contendo 20-30 mL de buffer 1. </li><li> Retire a cápsula de Glisson do fígado e agitar o celulars no líquido. </li><li> À medida que o líquido se torna opaco com material celular, transferência de células através de uma malha M 100 seguido por filtração através de uma malha M 30 e, em seguida, em um 50 mL cônico no gelo. </li><li> Adicionar mais um buffer para o fígado e continuar balançando as células hepáticas a partir da matriz, transferindo o líquido para os filtros de malha e cônico. </li><li> Repita os passos de 3,7-3,9 até que não haja mais células pode ser desalojado com agitação razoável do fígado. </li></ol> 4. Purificação dos hepatócitos e SEC <ol><li> Centrífuga de 50 mL contendo células conicals a 150 xg por 3 min. pellet para os hepatócitos. </li><li> Alienar a fração líquida contendo células não-parenquimatosas a fresco 50 mL conicals no gelo. </li><li> Lavar os hepatócitos ser ressuspender o sedimento em tampão 3 e repetindo os passos 4.1 e 4.2 mais três vezes. </li><li> No final da lava, as pelotas são ≥ 97% hepatócitos puro. Para obter a SCEE, centrifugar todos os tubos containing pooled sobrenadante (contendo HSCs, SECS, e KCs e alguns hepatócitos pequenos) a 200 xg por 10 min. a 4 ° C. </li><li> Aspirar o buffer e ressuspender todos os pellets em 5 mL RPMI / BSA a 4 ° C. </li><li> Piscina as células juntas em 2 tubos e adicionar RPMI / BSA até um volume de 35 mL. </li><li> Centrifugar a 100 xg conicals por 3 min. </li><li> Recolher o top 25 mL de líquido e transferir para um limpo 50 ml. </li><li> Ressuspender o sedimento em media os restantes 10 mL e adicionar novamente 25 mL de frio RPMI / BSA e centrifugar a 100 xg por 3 min. </li><li> Repita os passos 3.8 e 3.9, uma vez mais, descartar o pellet celular e menor media 10 mL. </li><li> Centrifugar a supernatents para pellet SCEE, KCs e HSCs a 200 xg por 10 min. a 4 ° C. </li><li> Preparar três tubos de 50 mL contendo 20 mL de Percoll 25% em PBS sobre o gelo. Underlay com 15 mL de Percoll 50% em cada tubo. </li><li> Ressuspender o pellets de células em um volume total de 30 mL RPMI / BSA. </li><li> Cuidadosamente overlay each gradiente com 10 mL de células e centrifugação a 900 xg por 20 min a 4 ° C. </li><li> SCEE e KCs têm muito perto densidade de flutuação e estão na interface 25/50%. HSCs são tipicamente menos os 25% / media de interface devido à sua maior flutuabilidade como células lipídicas armazenamento. Qualquer hepatócitos remanescentes e as células sanguíneas têm a menor e são buoyancies peletizada. Aspirar de cima para baixo perto da interface 25/50% e descartar este material. </li><li> Coletar as células na interface de 25/50% e transferir para um cônico fresco com RPMI frio. O volume final deve ser ~ 40 mL para diluir o Percoll. </li><li> Centrifugar a cônica em 350 xg por 10 min a 4 ° C para agregar as células. </li><li> Ressuspender as células em ~ 10 mL pré-aquecido RPMI contendo 100 U / mL Penicillin/100 células g / mL estreptomicina e coloque em um ácido lavado prato de vidro Petri ou cristalização prato. </li><li> Incubar as células por 15 min. a 37 ° C em uma incubadora de cultura de tecidos. </li><li> Rocha ou redemoinho da placa um poucoe depois recolher os SECS no sobrenadante. O KCs aderir ao vidro muito mais rapidamente do que SCEE. Alternativamente, SCEE pode ser separado por KCs immunopurification utilizando anticorpos anti-CD31 ou anti-Stabilin2/HARE conjugado com esferas magnéticas. </li><li> Números e viabilidade celular pode ser avaliado pela exclusão do azul tripan utilizando um hemocitômetro ou com o uso de um contador de células automatizado. </li><li> Cultura da SCEE em fibronectina revestido pratos de plástico, a 37 ° C, 5% CO 2, BSA RPMI/0.25% com 40 ng / mL VEGF, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / mL ou com hepatócitos media condicionado. </li><li> Hepatócitos, KCs e SCEE pode ser avaliar para a internalização do material marcado pelo uso de um contador gama e normalizar a proteína celular total ou por microscopia (se fluorescente etiquetado) com estes métodos de cultivo. </li></ol> 5. Resultados representativos: Purificação dos hepatócitos é ≥ 97% e purificação SEC é typicaliado ≥ 95% usando este método. Excisão da cavidade abdominal, canulação da veia porta, e branqueamento do fígado todos devem ocorrer dentro de um minuto para obter os melhores resultados. HARE/Stabilin-2 é um receptor específico na SCEE fígado e não é expressa em outros tipos de células do fígado. Nesta amostra, lisados ​​celulares de ambos os hepatócitos e SCEE foram separados em 5% SDS-PAGE e sondou com um anticorpo monoclonal contra ambas as isoformas da Stabilin-2 (Fig. 3). Heparina não fracionada injetada na corrente sanguínea é eliminado pelo fígado 16. Depuração é realizada principalmente pela SCEE fígado, em contraste com hepatócitos e KCs 17. O receptor Stabilin-2/HARE é o receptor que se liga clearance principal e internaliza heparina em SCEE 18. No nosso exemplo aqui, nós rotulados heparina com uma tag biotina sobre o grupo carboxilato de GlcNAc / NS. A biotina foi conjugado com estreptavidina iodado para a detecção de prot heparina internalizadoeoglycan. Injeção de heparina marcada seguido por exsangüinação 30 minutos após a injecção nos permite monitorar os órgãos internalizar esta forma de heparina. Neste curto intervalo de tempo, o fígado é o órgão de folga primário (Fig. 4). Para compreender mais claramente que tipo de célula é responsável pela depuração, acrescentamos 125 I-SA-b-Hep à mídia RPMI suplementado com BSA 0,05% e permitiu que a circular através do fígado por 20 min. Após digestão com colagenase e purificação celular, a grande maioria de heparina marcada é internalizada pela SECS, em contraste com hepatócitos (Fig. 5). <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Fígado arquitetura Basic. SCEE formam as paredes dos sinusóides e são normalmente fenestrado (pequenos grupos de círculos). Células estreladas (HSCs) são encontrados no espaço de Disse, em contraste com Kupffer cells (KCS), que estão normalmente presentes na microcirculação dos sinusóides. Hepatócitos ocupar o outro lado do espaço de Disse. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Esquemática do aparelho de perfusão. A) Set-up do aparelho durante a lavagem / lavagem dos sinusóides do fígado. TBS está num frasco de 1 L. B) Um frasco contendo 125 mL a 60 mL de buffer 2 com colagenase é utilizada para a digestão do fígado em um circuito fechado. A linha de efluentes também é alterada a partir do recipiente de resíduos de frasco B através de um corte entalhe na tampa de borracha. A linha de oxigênio não é submerso no buffer contendo colagenase (B frasco) para evitar a formação de espuma. As rolhas em cada frasco são entalhados para permitir a transferência eficiente da linha de efluentes e para evitar aumento da pressão do gás oxigênio. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. </spreparações trong&gt; Hepatócito não estão contaminados com SCEE. Quantidades iguais de lisados ​​celulares de lotes purificada dos hepatócitos (pista 1) e SECS (pista 2) foram separados em 5% SDS-PAGE e apagou a nitrocelulose. Anticorpo monoclonal # 30, que é específica contra ambas as isoformas (315 kDa e 190 kDa) de HARE/Stabilin-2 foi usado para investigar o lisados. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Distribuição de heparina rotulados de órgãos. Ratos foram injetados através da veia caudal lateral com 125 wait I-SA-b-hep por 30 minutos e depois sangrar. O sangue foi coletado de forma a não dar quaisquer órgãos artificialmente leituras elevadas. Contagens por minuto (CPM) de cada órgão foram normalizados contra o peso do órgão em gramas. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Quantidade de heparina rotulado em hepatócitos e SCEE. RPMEu mídia contendo 125 I-SA-b-Hep foi autorizado a circular através de um fígado intacto por 20 min seguida de digestão da colagenase e purificação celular. Quantidades iguais de hepatócitos e SEC lisados ​​proteínas celulares foram quantificados com o Ensaio de Bradford e contados por um contador gama. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6 células. Kupffer estão separados SECS pela adesão em vidro. As células foram colocadas em um prato de vidro lavado com ácido e cristalização e permitiu a aderir por 15 min a 37 ° C, 5% CO 2. O sobrenadante contendo células não-aderidas foi agitado suavemente e colocado em um tubo de centrifugação. Lisados ​​de ambas as células aderidas em vidro (pista 1) e de células não-aderidas (pista 2) foram separados em 8% SDS-PAGE, apagado, e sondou com um anticorpo contra a CD163, que é específico para células de Kupffer. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. SECS plaqueadas em plástico revestido fibronectina 6-bem pratos foram incubadas durante a noite em RPMI suplementado com BSA 0,1%. Imagens de contraste de fase foram tomadas a (A) 100x e (B) ampliação 200x.

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Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Anestesia do rato pelo método de gota em suspensão em que o isoflurano vapor induz a inconsciência é o método preferido para os nossos estudos. Um vaporizador também pode ser usado em vez de uma seringa com algodão para manter o animal fora da câmara, mas os procedimentos cirúrgicos são tão rápidos, não é necessário. Polietileno glicol é adicionado ao isoflurano para diminuir a pressão de vapor e taxa de evaporação. Muito vapor isoflurano vai induzir a morte muito rapidamente. Se o animal morrer antes do fígado é canulada e escaldados com TBS, o acúmulo de sangue pode formar coágulos no fígado e prevenir a lavagem eficiente dos sinusóides e digestão com colagenase. A adição de heparina pode ser útil como um anticoagulante mas não é usado nesses estudos, já que utilizamos heparina rotulados como nossa sonda. Gey solução tamponada de salina (GBSS) é muitas vezes substituído por outros laboratórios para a purificação de SCEE. Embora seja útil para a SEC purificação, hepatocytes não toleram GBSS bem como Buffers 1-3 e viabilidades não são tão altos. Ao medir a endocitose, é uma boa prática para medir os níveis de fundo no órgão e em hepatócitos purificada. Este método é um dos dois para a purificação eficiente da SCEE após a perfusão hepática com colagenase. O outro método separa as células não-parenquimatosas por centrifugação elutriação 19 em vez de gradiente de Percoll. As vantagens para a utilização de mais de elutriação gradientes de Percoll são viabilidades celulares ligeiramente maior e números. A desvantagem é que a centrifugação elutriação requer um rotor especializados, dedicados centrífuga, e bomba peristáltica juntos que custa dezenas de milhares de dólares. Este método requer apenas o uso de uma centrífuga refrigerada de bancada e uma bomba peristáltica que é padrão em muitos laboratórios. Separação de segundos e KCs por adesão seletiva é um método padrão20-22. Embora seja verdade que SCEE vai aderir ao vidro e plástico, o ponto chave é usar ácido lavou o vidro limpo, com não mais do que 15 minutos de incubação a 37 ° C em 5% CO 2. KCs sempre aderem mais rápido do que segundos e é aconselhável lavar cuidadosamente a KCs com a mídia para extrair qualquer SECS restantes que tornaram-se frouxamente ligados. Pronase e outras proteases também são omitidos os passos colagenase digestão neste protocolo para aumentar a viabilidades das células. Proteases digerir receptores extracelulares e pode inibir a adesão celular nas etapas de purificação final. O método aqui apresentado tem uma grande variedade de aplicações. Embora nós mostramos o resultado final em que a heparina é inicialmente assumido para a perfusão de apuramento, do fígado para a obtenção de hepatócitos primários, KC, SECS, e HSCs pode ser útil para uma série de estudos envolvendo vias metabólicas, imunorregulação, atividades de catadores, e outros fisiológicas studies. A parte mais difícil deste procedimento é canulação boa, a digestão do fígado, e manuseio do fígado sem ter o deslizamento cateter da veia portal.

<ul><li> Buffer 1: 142 mM NaCl 6,7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,5% BSA, pH 7,4 </li><li> Buffer de 2 (tampão de perfusão): 67,0 mM NaCl, 6,7 mM KCl, 4,8 mM CaCl 2-H2O, 101,0 mM HEPES, BSA 1,5%, pH 7.4. </li><li> Buffer de três: 137 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,7 mM MgSO 4, 1,2 mM CaCl 2 2H 2 O, 10 mM HEPES, 1,5% BSA, pH 7,4 </li><li> RPMI / SC: 15g / L BSA em RPMI </li><li> TRIS-buffered salina (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM de sal Base de Dados de Trizma. </li><li> Colagenase: colagenase A (# 11088785103) da Roche, colagenase tipo I (# LS004691) de Worthington Biochemical ou eu colagenase (# C0130) ou IA (# C9891) da Sigma-Aldrich. </li></ul> Todos os sais são da Sigma-Aldrich <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Modelo / catalogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Banho de água 20L </td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td> Água é de aproximadamente 45 ° C para compensar refrigeração </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> dentro da tubulação. </td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-70 </td><td> Masterflex série </td></tr><tr><td> Centrífuga refrigerada </td><td> Sorvall </td><td> Legenda XTR </td><td></td></tr><tr><td> Cateter </td><td> BD Biosciences </td><td> 381444 </td><td></td></tr><tr><td> Câmara exsicador </td><td> Pescador </td><td> 08595E </td><td> Use placa interna </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> SeraCare </td><td> AP-4510-01 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mesh mM </td><td> Espectro de laboratórios </td><td> 146488 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mesh mM </td><td> Espectro de laboratórios </td><td> 146506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870 </td><td></td></tr><tr><td> Polietileno glicol </td><td> Espectro de laboratórios </td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

O fígado é o centro metabólico do corpo dos mamíferos e serve como um filtro para o sangue. A arquitetura básica do fígado é ilustrado na figura 1, no qual mais de 85% da massa do fígado é composto por hepatócitos e os restantes 15% da massa celular é composta por células de Kupffer (KCS), células estreladas (HSCs), e sinusoidal células endoteliais (SCEE). SCEE formam as paredes dos vasos sanguíneos dentro do fígado e conter morfologia especializada chamada fenestras dentro do citoplasma. Fenestração do citoplasma é o aparecimento de buracos (~ 100 mm) dentro das células, para que o ato SECS como uma peneira em que a maioria quilomícrons, remanescentes de quilomícrons e macromoléculas, mas não células, passam para os hepatócitos e HSCs 1 (Fig. 1). Devido à falta de uma membrana basal, o fosso entre os segundos e hepatócitos formam o espaço de Disse. HSCs ocupar este espaço e desempenhar um papel proeminente na regulação e resposta ao injury, armazenamento de ácido retinóico e imunorregulação dos dois de fígado. SCEE estão entre as células mais ativas endocytically do corpo exibindo uma variedade de receptores scavenger em seus três superfície da célula. Estes incluem SR-A, Stabilin-1 e Stabilin-2. Geralmente, pequenas partículas coloidais menos de 230 nm e macromoléculas em fase de buffer são ocupados por SCEE, enquanto que, as partículas grandes e restos celulares é endocytosed (fagocitados) por KCs 4. Assim, a depuração maior parte do material extracelular, como os glicosaminoglicanos do sangue é em grande parte dependentes da saúde e as funções endocítica da SCEE 5,6. Por exemplo, um aumento dos níveis sanguíneos de ácido hialurônico é um indicativo de doença hepática variando de leve a formas mais graves 7. Com a exceção de um relatório de 8, não há linhas de células imortalizadas SEC na existência. Mesmo esta linha de células imortalizadas é de-diferenciadoated in que não expressam receptores scavenger que estão presentes em SECS primária (os nossos dados, não mostrados). Todos os estudos de células biológicas devem ser realizadas em células primários obtidos recentemente a partir do animal. Infelizmente, SCEE desdiferenciem sob condições de cultura padrão e deve ser utilizado dentro de 1 ou 2 dias após o isolamento do animal. Diferenciação do SCEE é marcada pela expressão de Stabilin-2 ou receptor HARE 9, CD31, ea presença de fenestração citoplasmática 1. Diferenciação do SCEE pode ser estendido com a adição de VEGF em meios de cultura ou cultura de células em meio condicionado de hepatócitos 10,11. Neste relatório, vamos demonstrar a atividade endocítica da SCEE no órgão intacto utilizando rádio-etiquetados heparina de ácido hialurônico para a SEC-receptor específico Stabilin-2. Nós, então, purificar hepatócitos e SCEE do fígado perfundido para medir a endocitose.

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In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

O estudo do fígado sinusoidal células endoteliais (SCEE) devem ser realizados com células primárias provenientes do animal como não existem linhas celulares. Este método baseia-se na digestão de fígado e centrifugação diferencial para SEC purificação para a cultura subseqüente e experimentação.

Endocitose em Fígado vivo seguidos de purificação de células do fígado por perfusão de fígado

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

in-vivo-liver-endocytosis-followed-purification-liver-cells-liver

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

18.9K visualizações.  University of Nebraska, Lincoln. O estudo do fígado sinusoidal células endoteliais (SCEE) devem ser realizados com células primárias provenientes do animal como não existem linhas celulares. Este método baseia-se na digestão de fígado e centrifugação diferencial para SEC purificação para a cultura subseqüente e experimentação.

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Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Isolamento de CD133 + células tronco do fígado de Expansão Clonal

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Biologia

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Isolamento de fibroblastos de rato por Portal<em&gt; In situ</em&gt; Perfusão de fígado

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is often not detected until drugs have reached clinical stages, risking patients' safety and leading to substantial losses for the pharma industry. Taking into account that standard 2D models have limitations in detecting DILI it is essential to develop in vitro models that are more predictive to improve data translatability. To understand causality and mechanistic aspects of DILI in detail, a human liver MPS consisting of human primary liver parenchymal and non-parenchymal cells (NPCs) and cultured in 3D microtissues on an engineered scaffold under perfusion has been developed. Cryopreserved primary human hepatocytes (PHHs) and Kupffer cells (HKCs) were cocultured as microtissues in the MPS platform for up to two weeks, and each compound of interest was repeatably dosed onto liver microtissues at seven test concentrations for up to four days. Functional liver-specific endpoints were analyzed (including clinical biomarkers such as alanine aminotransferase, ALT) to evaluate liver function. Acute and chronic exposure to compounds of various DILI severities can be assessed by comparing responses to single and multi-dosed microtissues. The methodology has been validated with a broad set of severe and mildly hepatotoxic compounds. Here we show the data for pioglitazone and troglitazone, well-known hepatotoxic compounds withdrawn from the market for causing liver failures. Overall, it has been shown that the liver MPS model can be a useful tool to assess DILI and its association with changes in hepatic function. The model can additionally be used to assess how novel compounds behave in distinct patient subsets and how toxicity profiles may be affected by liver disease states (e.g., viral hepatitis, fatty liver disease).

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

Drug-induced liver injury (DILI) is a major cause of drug failure. A protocol has been developed to accurately predict the DILI liability of a compound using a liver microphysiological system (MPS). The liver model uses the coculture of primary hepatic cells and translationally relevant endpoints to assess cellular responses to treatment.

Sistema Microfisiológico do Fígado Humano para Avaliação da Toxicidade Hepática Induzida por Drogas In Vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.