Este método pode nos ajudar a abordar questões-chave sobre o papel das vesículas extracelulares in vivo, fornecendo-nos uma fonte de vesículas que são representativas do microambiente tecido local. Estudos de vesículas extracelulares dentro do meio tecidual podem aprofundar nossa compreensão dos papéis fisiológicos das vesículas extracelulares e suas alterações nos processos fisiofóficos in vivo. Uma demonstração visual da cannulação da veia do portal é útil, pois o pequeno tamanho da veia dificulta a manipulação.
Demonstrando o procedimento com a Doutora Kaori Ishiguro estará Irene Yan, uma tecnóloga de pesquisa do meu laboratório. Antes de iniciar o procedimento, fixe os membros de um rato anestesiado e conecte a agulha de calibre 23 de uma coleta de sangue alado definida à extremidade livre de um pedaço de tubo de bomba de seringa. Limpe a pele abdominal do camundongo com 70% de etanol e uma almofada de álcool e use uma tesoura para abrir o rato do anterior do peito até o osso pélvico, tomando cuidado para não danificar nenhum órgão interno.
Use um aplicador de ponta de algodão para mover suavemente os intestinos para o lado direito da cavidade abdominal para expor a veia portal e a veia inferior cava e usar fórceps curvos para colocar um fio sob a veia portal. Amarre um nó livremente na sutura para se preparar para cinching após a cannula e encher a cânula com 40 graus Celsius HBSS até que a solução atinja a ponta da agulha da cânula. Insira a cânula na veia portal de cinco a 10 milímetros abaixo da ligadura e fixe a cânula com a sutura.
Inicie a infusão a uma taxa de fluxo de um a dois mililitros por minuto. Se a cânula foi corretamente colocada, o fígado começará a branquear. Corte a veia cava inferior e deixe o fluido excessivo dentro do fígado drenar.
Aumente lentamente a vazão para oito mililitros por minuto até que 50 mililitros completos de HBSS tenha sido perfundido através do fígado durante os próximos cinco minutos. Pouco antes do HBSS acabar, mude recém-preparada 40 graus Celsius colagenase quatro solução para o béquer perfusado e use fórceps para aplicar pressão transitória à veia cava inferior em intervalos de cinco segundos para fazer com que o fígado incha e ajude com a digestão e dissociação do tecido. À medida que a digestão progride, o fígado vai inchar e ficar branco.
Quando os restos mortais ficar deprimidos após sondagem suave com um aplicador de ponta de algodão, pare a bomba e remova a cânula. Remova a vesícula biliar do fígado, tomando cuidado para não rasgar o tecido da vesícula biliar, e use tesouras limpas e fórceps para colher o fígado em um prato de cultura estéril de 10 centímetros de PBS. Após lavagem suave, transfira o fígado para um novo prato de cultura de 10 centímetros contendo uma solução de colagem fresca quatro e use dois fórceps limpos para rasgar o fígado enquanto treme suavemente para dissociar as células do tecido hepático.
Quando todo o órgão for fragmentado, use uma seringa de três mililitros para triturar o chorume tecidual até que os pedaços não digdigestos do fígado sejam sacudidos. Despeje a solução celular resultante através de um coador de malha de nylon de 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros, lavando o prato com HBSS para coletar quaisquer células restantes. Acumule a lavagem com a suspensão de célula única e remova os hepatócitos por centrifugação.
Em seguida, transfira o supernatante para um novo tubo de 50 mililitros. Para remover quaisquer outras células, centrifugar o supernaente antes de transferir para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Remova as células mortas com outra centrifugação e transfira o supernante para um tubo de fundo redondo para remover quaisquer detritos celulares e agregados.
Agora transfira o supernascedor para um tubo de ultra centrífuga de policarbonato e resuspende a pelota em cerca de 20 mililitros de PBS para uma segunda e última ultra centrifugação. Em seguida, resuspenda a pelota de nanovescula extracelular em um mililitro de PBS para menos 80 graus Celsius de armazenamento se as vesículas não forem imediatamente analisadas. De um único fígado de camundongo, este método produz uma concentração de vesícula extracelular de tecido que varia de 1,74 a quatro vezes 10 até o décimo segundo com uma média de 3,46 vezes 10 para as partículas décima segunda por mililitro, conforme determinado pela análise de rastreamento de nanopartículas.
O tamanho médio das vesículas extracelulares do tecido hepático isolado é de 157,7 nanômetros com um tamanho de modo de 144,5 nanômetros e tamanhos de vesículas extracelulares que variam de 100 a 600 nanômetros por análise de rastreamento de nanóculas. As vesículas extracelulares isoladas usando essa abordagem são adequadas para aplicações a jusante e a caracterização adicional pode incluir avaliações morfológicas por eletromicroscopia ou análise de seus marcadores ou conteúdo de superfície.
