Os autores gostariam de agradecer a Tiffany Cereja em sua ajuda na otimização deste protocolo. Este trabalho foi financiado pelo National Institute of Aging (AG032320), bem como Avançando um Wisconsin saudável.

Consulte a Figura 1 para um esquema básico do início procedimento com o homogeneizado. Tempo estimado desde a preparação de extratos celulares para eluição de Cam-bound proteínas é de cerca de 6-7 horas. 1. Preparação dos tecidos <ol><li> Injetar organotípicas fatias do hipocampo com um vírus que contém um plasmídeo expressando a proteína recombinante de interesse (neste exemplo, proteína fluorescente verde (GFP) marcadas Ng) e permitir que o tecido que expressam a proteína durante a noite. </li><li> Cerca de 12 a 18 horas após a injeção viral (dependendo da época expressão viral), prepare-se para coletar o tecido. Adicionar tampão dissecção 1mL (glicose 10mM, KCl 4 mM, NaHCO3 26mm, sacarose 233mM, MgCl 5mM 2, 1 mM CaCl 2, e 0,1% de fenol-vermelho, gaseados com 5% de CO 2 95% O 2) a uma placa de Petri. Transferência de tecido cultivado / inserir a placa de Petri e adicionar 2 ml de buffer dissecção para a inserção de submergir o tecido. </li><li> Coletat organotípicas tecido do hipocampo (entre 5 e 10 fatias) delicadamente raspando o tecido livre da membrana inserção utilizando um bisturi. Especificamente a remoção de uma determinada região de interesse (por exemplo, CA1) também é uma opção. Transferência de suspensão do tecido para um tubo de microcentrífuga 1,5 ml usando uma pipeta Pasteur invertida. </li><li> Centrifugar amostras em 1500 rcf para 1 min para separar tecido do tampão dissecção. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. </li><li> Para cada fatia usada, adicione 30-60 mL de tampão de homogeneização (150mm NaCl, 20mM Tris pH 7.5, 1mM DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL Antipaína, pepstatin 1μg/mL, e 1% Triton X -100) para o tecido e homogeneizar cuidadosamente com o pilão. </li><li> , A fim de remover os restos celulares, centrifugar o homogeneizado restante em 1100 rcf durante 10 minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, evitando a contaminação do sedimento. </li><li> Ter 10% do sobrenadante como amostra da entrada (amostra 1). Guarde o sobrenadante restante no gelo durante a preparação das contas CaM-sepharose para uso no passo 3. </li></ol> Nota: O tecido utilizado aqui estão organotípicas fatias do hipocampo. No entanto, pode-se usar os neurônios dissociados ou qualquer sistema de cultura de outras células. Nesse caso, comece com a etapa 1,4 depois de coletar o tecido de maneira apropriada. 2. Preparação de grânulos de pull-down No manuseio das contas, é importante para salvar as contas e maximizar a eficiência das reações, impedindo as contas de secagem sobre os lados do tubo. Para isso, é melhor para rodar seus tubos do lado deles, permitindo que solução para molhar as contas nas paredes do tubo, imediatamente antes da centrifugação. <ol><li> Para cada pull-down, pipeta de 400 mL suspensão Calmodulina Sepharose-beads em um tubo de microcentrífuga 2 mL com um fla relativamentet-bottom para maximizar a área de superfície e interação de suas soluções com as contas durante a sua incubação. </li><li> Centrífuga contas a 21.000 rcf durante 30 segundos e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar as contas. </li><li> Para lavar as contas, adicionar 100 mL do tampão de homogeneização respectivos contendo um ou dois mM CaCl 2 para aqueles que estão sendo usados ​​para puxar para baixo Ca 2 +-CaM proteínas de ligação e 2 mM EDTA (um conhecido Ca 2 + quelante) para contas puxando para baixo ApoCaM proteínas de ligação. Bata suavemente o tubo para re-suspender contas e centrifugar a 1500 rcf para 1 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, certificando-se para não perturbar as contas. </li></ol> Nota: Para todos os passos de aspiração, é recomendado o uso de uma ponteira que tem uma abertura fina (por exemplo, dicas de carga gel) para permitir a remoção da solução sem remover contas. 3. CaM-sepharose ligação de proteínas <ol><li> Dividir o seu sobrenadante em duas condições que contenham um volume igual. Dependendo da sua condição, adicionar a quantidade apropriada de CaCl 2 ou EDTA para o sobrenadante até 2 mM para cada concentração. </li><li> Adicionar sobrenadante do passo de 1,7 a contas lavados em tampão de homogeneização correspondente. Bata suavemente o tubo para misturar. </li><li> Incubar as amostras a 4 ° C por 3 horas em uma coqueteleira. Re-suspender contas a cada 30 minutos ou mais para aumentar a eficiência da ligação. </li><li> Tubo de centrífuga contendo amostras e contas de 1500 rcf durante 3 min. </li><li> Tome 50μL do sobrenadante como amostra de proteína unbound (amostra 2) e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração e restantes descartar. </li><li> Lavar contas três vezes como descrito no passo 2,3 utilizando 100μL de tampão de homogeneização respectivos. </li></ol> 4. Eluição <ol><li> Adicionar 50μL de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl pH 7.5, NaCl e 150 mm), contendo a condição oposta (10mM CaCl 2 ou 10mM EDTA) para as contas. Por exemplo, as amostras que foram homogeneizadas e ligado em tampão contendo Ca 2 + são eluídos em tampão de eluição contendo EDTA e vice-versa. </li></ol> Opcional: O aquecimento do tampão de eluição a 37 ° C antes de adicionar contas pode aumentar o rendimento. <ol start="2"><li> Incubar solução com contas em temperatura ambiente por 30 min em um agitador. Misture as contas batendo o tubo a cada 5 min. </li><li> Centrífuga contas em 1500 rcf por 3 min e remova cuidadosamente a 50μL do sobrenadante para a ligação às proteínas (amostra 3) por aspiração. Certifique-se de não perturbar as contas. </li><li> Adicionar tampão de carregamento de proteína para todas as amostras (ou seja, proteínas unbound homogeneizado, e amarrou bem como aqueles que ainda estão vinculados às esferas). </li></ol> Nota: Para maximizar a eluição (especialmente no caso de eluição ineficiente), adicionar 50μL do tampão de eluição correspondentes (por exemplo, a adição de EDTA buf contendofer de contas vinculadas em CaCl 2) para as contas antes de aquecer as amostras para ajudar a eluir qualquer proteína ligada restantes e repita os passos descritos no item 4.3 para remover proteínas restantes vinculados. 5. SDS-PAGE e western blot Conduta SDS-PAGE e analisar usando western blot sondando para a sua proteína de interesse e sonda para uma proteína conhecida por se ligar CaM na condição oposta como controle positivo. 6. Resultados representante Figura 2B mostra um exemplo de um ensaio de CaM-pull-down testar a ligação da CaM GFP-tagged Ng comparação com Ng endógena. Para isso, GFP-Ng foi overexpressed em nosso organotípicas fatias do hipocampo durante a noite e o tecido foi homogeneizado. O homogenato foi incubado com CaM-sepharose contas na presença de um Ca 2 + ou EDTA. Homogenato de entrada mostra que a GFP-Ng foi expressa, além de Ng endógenos e Ca 2 + / CaM quinase II dependente de(CaMKII). Como era esperado com base na ligação conhecida de Ng endógena (ilustrado na figura. 2A), GFP-tagged Ng foi eluída na ausência de Ca 2 + (EDTA ligação às proteínas) e não ligado, na presença de Ca 2 + (Fig. 2B) . Em contraste, o controle, CaMKII, foi eluído apenas na presença de Ca 2 + (proteínas) e foi unbound na sua ausência (EDTA). Isso mostra que as contas foram CaM funcionando corretamente eo elutions foram eficientes. Mais importante, isso mostra que GFP-Ng se liga a ApoCaM de forma semelhante à forma endógena, sugerindo que a tag GFP não alterou a função da nossa proteína recombinante. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Esboço figura 1. CaM do ensaio de pull-down (A) homogeneizado de tecido é girado para baixo para remover os restos celulares. Cerca de 10% do sobrenadante é tida como uma amostra da entrada (1). O sobrenadante restante é dividido igualmente para os diferentescondições e os reagentes apropriados (CaCl 2 ou EDTA) são adicionados ao teste obrigatório em tais condições. Cada sobrenadante (contendo um ou outro CaCl 2 ou EDTA) é carregado no respectivamente preparado CaM-sepharose contas e (B) incubado para permitir a ligação. Proteínas não ligados são removidos (2) e (C) as proteínas ligados (3) são eluídos fora das esferas usando tampão de eluição (EB), contendo a condição oposta, como a ligação. A composição das proteínas dessas três amostras de proteínas podem ser analisadas utilizando SDS-PAGE e western blot. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. A. esquemática) de Ca 2 + dependentes de ligação CaM e eluição em Exemplos de pull-down ensaio são dadas de dois tipos de proteínas que se ligam CaM em Ca 2 + forma-dependente. Neurogranin (Ng) representa proteínas que se ligam apo-CaM e CaMKII representa proteínas que se ligam ao Ca 2 + ricosCaM. CaM é mostrada em seu estado dissociado antes da incubação com as proteínas homogeneizado. Uma vez incubados sob condições de altas concentrações de Ca 2 + (2 mM) ou na presença de um quelante de Ca 2 +, EDTA (2 mM), as proteínas se ligam a CaM em conformidade. Ng liga CaM na condição de EDTA como há pouca ou nenhuma Ca 2 + presente, e seria eluído fora as contas CaM-sepharose na presença de Ca 2 +. CaMKII, porém, se ligariam a CaM na presença de quantidades elevadas de Ca 2 + e que dissociar uma vez que o Ca 2 + foi quelatado. B.) Os resultados de CaM exemplo pull-down ensaio. Este número demonstra o resultado final esperado de um CaM-sepharose puxar para baixo com as amostras sondado por Ng e CaMKII. Ambos Ng endógeno e GFP-Ng estão presentes nas pistas de proteínas ligados a CaM na presença de EDTA. Ng não é obrigado quando as amostras são incubadas com CaM na presença de Ca 2 +, demonstrando que Ng só liga apo-CaM. Nosso controle positivo, CaMKII, por outro lado, liga-se a CaM apenas na presença de Ca 2 +.

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	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo fornecido utiliza CaM-sepharose contas para investigar o Ca 2 + dependência da CaM proteínas de ligação. Muitas proteínas se ligam CaM em uma Ca 2 + forma-dependente. Essas interações são de grande importância dado o número de CaM proteínas de ligação e seu papel crítico em muitas vias de sinalização. Neste protocolo, CaM-sepharose contas são usadas para separar CaM proteínas de ligação a partir de homogeneizado de tecido na presença ou ausência de Ca 2 +.</su...

<table border="1"><tr><td> Produto </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Calmodulina-Sepharose contas </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CamKII alpha </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Dicas Pipetar Loading </td><td> Pescador </td><td> 02-707-138 </td><td> Use para aspiração de sobrenadantes </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga (2,0 mL) </td><td> Pescador </td><td> 05-408-146 </td><td> Use para todas as etapas que envolvem a calmodulina-sepharose contas </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Cálcio (Ca 2 +) é um íon vital na regulação da função celular através de uma variedade de mecanismos. Muito do Ca 2 + de sinalização é mediada através da proteína de ligação de cálcio conhecido como calmodulina 1,2 (CaM). CaM está envolvido em vários níveis em quase todos os processos celulares, incluindo apoptose, o metabolismo, a contração do músculo liso, plasticidade sináptica, o crescimento do nervo, inflamação e da resposta imune. Uma série de proteínas ajudam a regular essas vias através de sua interação com CaM. Muitas dessas interações dependem da conformação da CAM, que é distintamente diferente quando ligado a Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) em oposição à sua Ca 2 + estado livre (ApoCaM) 3. Enquanto a maioria das proteínas-alvo bind Ca 2 +-CaM, algumas proteínas só se ligam a ApoCaM. Alguns ligam-se através CaM seu QI de domínio, incluindo neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, e miosinas certos <sup&gt; 6. Essas proteínas têm sido mostrados para desempenhar um papel importante na função pré-sináptica 7, função pós-sinápticos 8, e 9 a contração muscular, respectivamente. Sua capacidade de ligar e liberar CaM na ausência ou presença de Ca 2 + é central na sua função. Em contraste, muitas proteínas se ligam apenas Ca 2 +-CaM e exigem esta ligação para sua ativação. Exemplos incluem a quinase da cadeia leve da miosina 10, Ca 2 + / CaM quinases dependentes (CaMKs) 11 e fosfatases (por exemplo, da calcineurina) 12, e espectrina quinase 13, que tem uma variedade de efeitos diretos e jusante 14. Os efeitos destas proteínas em função celular são muitas vezes dependentes de sua capacidade de se ligar a CaM em Ca 2 + forma-dependente. Por exemplo, testamos a relevância da Ng-CaM obrigatório em função sináptica e como diferentes mutações afetam essa ligação. Geramos uma GFP-tagged con Ngstruct com mutações específicas no IQ-domínio que iria mudar a capacidade de Ng para ligar CaM em Ca 2 + forma-dependente. O estudo destas mutações diferentes nos deu grande insight sobre processos importantes envolvidos na função sináptica 8,15. No entanto, em tais estudos, é essencial para demonstrar que as proteínas mutantes têm a ligação esperada alterado para CaM. Aqui, apresentamos um método para testar a capacidade de se ligar a proteínas CaM na presença ou ausência de Ca 2 +, usando CaMKII e Ng como exemplos. Este método é uma forma de cromatografia de afinidade referido como um ensaio CaM pull-down. Ele usa CaM-Sepharose contas para testar as proteínas que se ligam ao CaM e à influência de Ca 2 + em essa ligação. É tempo consideravelmente mais eficiente e requer menos proteínas em relação a cromatografia de coluna e outros ensaios. Ao todo, este fornece uma valiosa ferramenta para explorar Ca 2 + / CaM sinalização e proteínas que, emteract com CaM.

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Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulina (CaM) ensaio de pull-down é uma maneira eficaz para investigar a interação de CaM com várias proteínas. Este método usa CaM-sepharose contas para análise eficiente e específica do CaM proteínas de ligação. Isto proporciona uma importante ferramenta para explorar sinalização CaM em função celular.

Pull-down da Calmodulina Proteínas de Ligação

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K visualizações.  Medical College of Wisconsin. Calmodulina (CaM) ensaio de pull-down é uma maneira eficaz para investigar a interação de CaM com várias proteínas. Este método usa CaM-sepharose contas para análise eficiente e específica do CaM proteínas de ligação. Isto proporciona uma importante ferramenta para explorar sinalização CaM em função celular.

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Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separação eletroforética de proteínas

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Biologia

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Coloração Proteínas em Gel

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Impressão microcontact de Proteínas de Biologia Celular

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Barcoding Genetic com proteínas fluorescentes para Aplicações Multiplexados

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).