Os autores gostariam de agradecer a Tiffany Cereja em sua ajuda na otimização deste protocolo. Este trabalho foi financiado pelo National Institute of Aging (AG032320), bem como Avançando um Wisconsin saudável.

Consulte a Figura 1 para um esquema básico do início procedimento com o homogeneizado. Tempo estimado desde a preparação de extratos celulares para eluição de Cam-bound proteínas é de cerca de 6-7 horas. 1. Preparação dos tecidos <ol><li> Injetar organotípicas fatias do hipocampo com um vírus que contém um plasmídeo expressando a proteína recombinante de interesse (neste exemplo, proteína fluorescente verde (GFP) marcadas Ng) e permitir que o tecido que expressam a proteína durante a noite. </li><li> Cerca de 12 a 18 horas após a injeção viral (dependendo da época expressão viral), prepare-se para coletar o tecido. Adicionar tampão dissecção 1mL (glicose 10mM, KCl 4 mM, NaHCO3 26mm, sacarose 233mM, MgCl 5mM 2, 1 mM CaCl 2, e 0,1% de fenol-vermelho, gaseados com 5% de CO 2 95% O 2) a uma placa de Petri. Transferência de tecido cultivado / inserir a placa de Petri e adicionar 2 ml de buffer dissecção para a inserção de submergir o tecido. </li><li> Coletat organotípicas tecido do hipocampo (entre 5 e 10 fatias) delicadamente raspando o tecido livre da membrana inserção utilizando um bisturi. Especificamente a remoção de uma determinada região de interesse (por exemplo, CA1) também é uma opção. Transferência de suspensão do tecido para um tubo de microcentrífuga 1,5 ml usando uma pipeta Pasteur invertida. </li><li> Centrifugar amostras em 1500 rcf para 1 min para separar tecido do tampão dissecção. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. </li><li> Para cada fatia usada, adicione 30-60 mL de tampão de homogeneização (150mm NaCl, 20mM Tris pH 7.5, 1mM DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL Antipaína, pepstatin 1μg/mL, e 1% Triton X -100) para o tecido e homogeneizar cuidadosamente com o pilão. </li><li> , A fim de remover os restos celulares, centrifugar o homogeneizado restante em 1100 rcf durante 10 minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, evitando a contaminação do sedimento. </li><li> Ter 10% do sobrenadante como amostra da entrada (amostra 1). Guarde o sobrenadante restante no gelo durante a preparação das contas CaM-sepharose para uso no passo 3. </li></ol> Nota: O tecido utilizado aqui estão organotípicas fatias do hipocampo. No entanto, pode-se usar os neurônios dissociados ou qualquer sistema de cultura de outras células. Nesse caso, comece com a etapa 1,4 depois de coletar o tecido de maneira apropriada. 2. Preparação de grânulos de pull-down No manuseio das contas, é importante para salvar as contas e maximizar a eficiência das reações, impedindo as contas de secagem sobre os lados do tubo. Para isso, é melhor para rodar seus tubos do lado deles, permitindo que solução para molhar as contas nas paredes do tubo, imediatamente antes da centrifugação. <ol><li> Para cada pull-down, pipeta de 400 mL suspensão Calmodulina Sepharose-beads em um tubo de microcentrífuga 2 mL com um fla relativamentet-bottom para maximizar a área de superfície e interação de suas soluções com as contas durante a sua incubação. </li><li> Centrífuga contas a 21.000 rcf durante 30 segundos e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar as contas. </li><li> Para lavar as contas, adicionar 100 mL do tampão de homogeneização respectivos contendo um ou dois mM CaCl 2 para aqueles que estão sendo usados ​​para puxar para baixo Ca 2 +-CaM proteínas de ligação e 2 mM EDTA (um conhecido Ca 2 + quelante) para contas puxando para baixo ApoCaM proteínas de ligação. Bata suavemente o tubo para re-suspender contas e centrifugar a 1500 rcf para 1 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, certificando-se para não perturbar as contas. </li></ol> Nota: Para todos os passos de aspiração, é recomendado o uso de uma ponteira que tem uma abertura fina (por exemplo, dicas de carga gel) para permitir a remoção da solução sem remover contas. 3. CaM-sepharose ligação de proteínas <ol><li> Dividir o seu sobrenadante em duas condições que contenham um volume igual. Dependendo da sua condição, adicionar a quantidade apropriada de CaCl 2 ou EDTA para o sobrenadante até 2 mM para cada concentração. </li><li> Adicionar sobrenadante do passo de 1,7 a contas lavados em tampão de homogeneização correspondente. Bata suavemente o tubo para misturar. </li><li> Incubar as amostras a 4 ° C por 3 horas em uma coqueteleira. Re-suspender contas a cada 30 minutos ou mais para aumentar a eficiência da ligação. </li><li> Tubo de centrífuga contendo amostras e contas de 1500 rcf durante 3 min. </li><li> Tome 50μL do sobrenadante como amostra de proteína unbound (amostra 2) e remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração e restantes descartar. </li><li> Lavar contas três vezes como descrito no passo 2,3 utilizando 100μL de tampão de homogeneização respectivos. </li></ol> 4. Eluição <ol><li> Adicionar 50μL de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl pH 7.5, NaCl e 150 mm), contendo a condição oposta (10mM CaCl 2 ou 10mM EDTA) para as contas. Por exemplo, as amostras que foram homogeneizadas e ligado em tampão contendo Ca 2 + são eluídos em tampão de eluição contendo EDTA e vice-versa. </li></ol> Opcional: O aquecimento do tampão de eluição a 37 ° C antes de adicionar contas pode aumentar o rendimento. <ol start="2"><li> Incubar solução com contas em temperatura ambiente por 30 min em um agitador. Misture as contas batendo o tubo a cada 5 min. </li><li> Centrífuga contas em 1500 rcf por 3 min e remova cuidadosamente a 50μL do sobrenadante para a ligação às proteínas (amostra 3) por aspiração. Certifique-se de não perturbar as contas. </li><li> Adicionar tampão de carregamento de proteína para todas as amostras (ou seja, proteínas unbound homogeneizado, e amarrou bem como aqueles que ainda estão vinculados às esferas). </li></ol> Nota: Para maximizar a eluição (especialmente no caso de eluição ineficiente), adicionar 50μL do tampão de eluição correspondentes (por exemplo, a adição de EDTA buf contendofer de contas vinculadas em CaCl 2) para as contas antes de aquecer as amostras para ajudar a eluir qualquer proteína ligada restantes e repita os passos descritos no item 4.3 para remover proteínas restantes vinculados. 5. SDS-PAGE e western blot Conduta SDS-PAGE e analisar usando western blot sondando para a sua proteína de interesse e sonda para uma proteína conhecida por se ligar CaM na condição oposta como controle positivo. 6. Resultados representante Figura 2B mostra um exemplo de um ensaio de CaM-pull-down testar a ligação da CaM GFP-tagged Ng comparação com Ng endógena. Para isso, GFP-Ng foi overexpressed em nosso organotípicas fatias do hipocampo durante a noite e o tecido foi homogeneizado. O homogenato foi incubado com CaM-sepharose contas na presença de um Ca 2 + ou EDTA. Homogenato de entrada mostra que a GFP-Ng foi expressa, além de Ng endógenos e Ca 2 + / CaM quinase II dependente de(CaMKII). Como era esperado com base na ligação conhecida de Ng endógena (ilustrado na figura. 2A), GFP-tagged Ng foi eluída na ausência de Ca 2 + (EDTA ligação às proteínas) e não ligado, na presença de Ca 2 + (Fig. 2B) . Em contraste, o controle, CaMKII, foi eluído apenas na presença de Ca 2 + (proteínas) e foi unbound na sua ausência (EDTA). Isso mostra que as contas foram CaM funcionando corretamente eo elutions foram eficientes. Mais importante, isso mostra que GFP-Ng se liga a ApoCaM de forma semelhante à forma endógena, sugerindo que a tag GFP não alterou a função da nossa proteína recombinante. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Esboço figura 1. CaM do ensaio de pull-down (A) homogeneizado de tecido é girado para baixo para remover os restos celulares. Cerca de 10% do sobrenadante é tida como uma amostra da entrada (1). O sobrenadante restante é dividido igualmente para os diferentescondições e os reagentes apropriados (CaCl 2 ou EDTA) são adicionados ao teste obrigatório em tais condições. Cada sobrenadante (contendo um ou outro CaCl 2 ou EDTA) é carregado no respectivamente preparado CaM-sepharose contas e (B) incubado para permitir a ligação. Proteínas não ligados são removidos (2) e (C) as proteínas ligados (3) são eluídos fora das esferas usando tampão de eluição (EB), contendo a condição oposta, como a ligação. A composição das proteínas dessas três amostras de proteínas podem ser analisadas utilizando SDS-PAGE e western blot. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. A. esquemática) de Ca 2 + dependentes de ligação CaM e eluição em Exemplos de pull-down ensaio são dadas de dois tipos de proteínas que se ligam CaM em Ca 2 + forma-dependente. Neurogranin (Ng) representa proteínas que se ligam apo-CaM e CaMKII representa proteínas que se ligam ao Ca 2 + ricosCaM. CaM é mostrada em seu estado dissociado antes da incubação com as proteínas homogeneizado. Uma vez incubados sob condições de altas concentrações de Ca 2 + (2 mM) ou na presença de um quelante de Ca 2 +, EDTA (2 mM), as proteínas se ligam a CaM em conformidade. Ng liga CaM na condição de EDTA como há pouca ou nenhuma Ca 2 + presente, e seria eluído fora as contas CaM-sepharose na presença de Ca 2 +. CaMKII, porém, se ligariam a CaM na presença de quantidades elevadas de Ca 2 + e que dissociar uma vez que o Ca 2 + foi quelatado. B.) Os resultados de CaM exemplo pull-down ensaio. Este número demonstra o resultado final esperado de um CaM-sepharose puxar para baixo com as amostras sondado por Ng e CaMKII. Ambos Ng endógeno e GFP-Ng estão presentes nas pistas de proteínas ligados a CaM na presença de EDTA. Ng não é obrigado quando as amostras são incubadas com CaM na presença de Ca 2 +, demonstrando que Ng só liga apo-CaM. Nosso controle positivo, CaMKII, por outro lado, liga-se a CaM apenas na presença de Ca 2 +.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo fornecido utiliza CaM-sepharose contas para investigar o Ca 2 + dependência da CaM proteínas de ligação. Muitas proteínas se ligam CaM em uma Ca 2 + forma-dependente. Essas interações são de grande importância dado o número de CaM proteínas de ligação e seu papel crítico em muitas vias de sinalização. Neste protocolo, CaM-sepharose contas são usadas para separar CaM proteínas de ligação a partir de homogeneizado de tecido na presença ou ausência de Ca 2 +.</su...

<table border="1"><tr><td> Produto </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Calmodulina-Sepharose contas </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CamKII alpha </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Dicas Pipetar Loading </td><td> Pescador </td><td> 02-707-138 </td><td> Use para aspiração de sobrenadantes </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga (2,0 mL) </td><td> Pescador </td><td> 05-408-146 </td><td> Use para todas as etapas que envolvem a calmodulina-sepharose contas </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Cálcio (Ca 2 +) é um íon vital na regulação da função celular através de uma variedade de mecanismos. Muito do Ca 2 + de sinalização é mediada através da proteína de ligação de cálcio conhecido como calmodulina 1,2 (CaM). CaM está envolvido em vários níveis em quase todos os processos celulares, incluindo apoptose, o metabolismo, a contração do músculo liso, plasticidade sináptica, o crescimento do nervo, inflamação e da resposta imune. Uma série de proteínas ajudam a regular essas vias através de sua interação com CaM. Muitas dessas interações dependem da conformação da CAM, que é distintamente diferente quando ligado a Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) em oposição à sua Ca 2 + estado livre (ApoCaM) 3. Enquanto a maioria das proteínas-alvo bind Ca 2 +-CaM, algumas proteínas só se ligam a ApoCaM. Alguns ligam-se através CaM seu QI de domínio, incluindo neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, e miosinas certos <sup&gt; 6. Essas proteínas têm sido mostrados para desempenhar um papel importante na função pré-sináptica 7, função pós-sinápticos 8, e 9 a contração muscular, respectivamente. Sua capacidade de ligar e liberar CaM na ausência ou presença de Ca 2 + é central na sua função. Em contraste, muitas proteínas se ligam apenas Ca 2 +-CaM e exigem esta ligação para sua ativação. Exemplos incluem a quinase da cadeia leve da miosina 10, Ca 2 + / CaM quinases dependentes (CaMKs) 11 e fosfatases (por exemplo, da calcineurina) 12, e espectrina quinase 13, que tem uma variedade de efeitos diretos e jusante 14. Os efeitos destas proteínas em função celular são muitas vezes dependentes de sua capacidade de se ligar a CaM em Ca 2 + forma-dependente. Por exemplo, testamos a relevância da Ng-CaM obrigatório em função sináptica e como diferentes mutações afetam essa ligação. Geramos uma GFP-tagged con Ngstruct com mutações específicas no IQ-domínio que iria mudar a capacidade de Ng para ligar CaM em Ca 2 + forma-dependente. O estudo destas mutações diferentes nos deu grande insight sobre processos importantes envolvidos na função sináptica 8,15. No entanto, em tais estudos, é essencial para demonstrar que as proteínas mutantes têm a ligação esperada alterado para CaM. Aqui, apresentamos um método para testar a capacidade de se ligar a proteínas CaM na presença ou ausência de Ca 2 +, usando CaMKII e Ng como exemplos. Este método é uma forma de cromatografia de afinidade referido como um ensaio CaM pull-down. Ele usa CaM-Sepharose contas para testar as proteínas que se ligam ao CaM e à influência de Ca 2 + em essa ligação. É tempo consideravelmente mais eficiente e requer menos proteínas em relação a cromatografia de coluna e outros ensaios. Ao todo, este fornece uma valiosa ferramenta para explorar Ca 2 + / CaM sinalização e proteínas que, emteract com CaM.

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Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulina (CaM) ensaio de pull-down é uma maneira eficaz para investigar a interação de CaM com várias proteínas. Este método usa CaM-sepharose contas para análise eficiente e específica do CaM proteínas de ligação. Isto proporciona uma importante ferramenta para explorar sinalização CaM em função celular.

Pull-down da Calmodulina Proteínas de Ligação

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

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25.2K visualizações.  Medical College of Wisconsin. Calmodulina (CaM) ensaio de pull-down é uma maneira eficaz para investigar a interação de CaM com várias proteínas. Este método usa CaM-sepharose contas para análise eficiente e específica do CaM proteínas de ligação. Isto proporciona uma importante ferramenta para explorar sinalização CaM em função celular.