Agradecemos Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) para, inicialmente, nos ensinando a técnica HGD e Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine), por sua orientação contínua em vários aspectos da tecnologia. Este trabalho foi financiado pelo Hunter College, CUNY arranque fundos e prêmio NSF Pão IOS-1249166. Agradecemos o apoio Grant NYULMC Histopatologia Núcleo NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 para histologia em fígado de camundongos.

Todos os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Uso do Hunter College, Universidade da Cidade de Nova York. 1. Preparação de ADN plasmídico sem endotoxinas <ol><li> Escolha de uma única colónia de bactérias, contendo o gene de interesse num vector de expressão de mamífero a partir de uma placa recentemente riscada selectiva. </li><li> Siga as recomendações encontradas no manual de um kit disponível comercialmente purificação plasmídeo livre de endotoxina para cultivo e colheita bactérias. </li><li> Purifica-se o plasmídeo de ADN livre de endotoxinas a partir de células bacterianas, seguindo o protocolo do kit de purificação de plasmídeo isento de endotoxina disponível comercialmente. </li><li> Use livre de endotoxina plásticas e lidar com DNA com cuidado para garantir que a endotoxina não é re-introduzida na amostra de DNA após a etapa de remoção. </li><li> Medir a concentração de DNA plasmídico sem endotoxinas por determinação da sua absorvância a 260 nm usando um micro-volume do espectrofotómetro de UV, como descrito abaixo, ou um padrão, baseada em espectrofotômetro cuvete. <ol><li> Limpar as superfícies ópticas inferiores e superiores do sistema de retenção de amostra espectrofotômetro micro como se segue. Pipetar 1 mL de água deionizada limpo no sistema óptico menor. Feche o braço de alavanca e toque-o algumas vezes para banhar o sistema óptico superior, em seguida, alavanca de abertura e limpe com um lenço de papel. </li><li> Abra o software do micro espectrofotómetro e seleccionar o módulo de ácidos nucleicos. </li><li> Coloque 1 ml de água deionizada limpa no sistema óptico inferior, o braço de alavanca e selecione &quot;inicializar&quot; do software do programa. Uma vez que a inicialização estiver superfícies completas, limpas tanto ópticos com um lenço de papel .. </li><li> Executar a medição em branco, carregando um ul de tampão TE isento de endotoxina (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; EDTA 1 mM) e seleccionando &quot;em branco&quot; do software do programa. Uma vez que a medição é feita em branco, superfícies limpas tanto ópticos com umtecido. </li><li> Realizar medição da amostra, carregando 1 ml de amostra de DNA livre de endotoxina e selecionando &quot;medida&quot; do software do programa. Registre a concentração de DNA. Avaliar a pureza do DNA através da gravação da relação absorbância 260/280 nm que aparece na tela. Uma vez que o uso de ADN puro (260/280 razão de 1,8) para HGD é altamente desejável, evitar a utilização de uma amostra de DNA com uma razão de 260/280 inferior a 1,7. Uma vez que a medição é feita, limpar ambas as superfícies ópticas com um tecido. </li></ol></li></ol> 2. Pesando de ratos <ol><li> Mark camundongos em uma forma apropriada para a tensão. Nota: marcação da cauda não é recomendado para este procedimento. <ol><li> Marcar espécie de rato que têm pele branca (por exemplo, Swiss Webster) em suas costas com um marcador preto. Reaplicar marcas ao longo do tempo, se necessário. </li><li> Mark espécie de rato que têm pele preta (por exemplo, C57BL / 6) pela orelha perfurando vários dias de antecedência. </li></ol></li><li> Pesar camundongos individually delicadamente colocando-os em um prato de pesagem ou animal balde colocado em uma balança de laboratório digital. Registar o peso de cada murganho utilizado na experiência, no dia da experiência. </li></ol> 3. Preparação de seringas <ol><li> Preparação da mistura de injeção <ol><li> Calcula-se a quantidade de DNA necessária, assumindo 5 - 50 ug livre de endotoxina plasmídeo de DNA para a injecção de cada rato. <ol><li> Determinar a quantidade óptima de DNA de plasmídeo experimentalmente. </li><li> Ao determinar a quantidade de DNA necessário, assumir a injeção de um rato adicional por grupo, como o carregamento adequado das seringas vai exigir algum mix injeção extra. Para ajudar os cálculos, considere o seguinte exemplo: injetar 4 camundongos experimentais e 4 de controle, cada um pesando 25 g, com 50 mg de plasmídeo de DNA por mouse. Para determinar a quantidade de DNA necessária neste caso, calcular com cinco ratinhos por grupo de: 5 x 50 mg = 250 ug de ADN necessário para cada grupo. </li></ol></li><li> Determinar a quantidade de soro fisiológico (cloreto de sódio a 0,9%) necessária, assumindo 10% do peso do corpo para a injecção de cada rato. <ol><li> De acordo com o exemplo acima, injecta-se 25 g de cada ratinho, com 50 ug de DNA de plasmídeo em 2,5 ml de solução salina (2,5 g de líquido). </li><li> Ao determinar a quantidade de soro necessária para todo um grupo de ratinhos, assumir a injecção de um rato por grupo adicional para permitir a colocação adequada das seringas. Considerando-se a experiência dada, calcular a quantidade de soro necessária para 5 ratinhos em cada grupo: 5 x 2,5 ml = 12.5 ml de solução salina por cada grupo (ou 25 ml no total). Nota: Se os ratos pertencentes ao mesmo grupo não são o mesmo peso (diferença de mais de 10% do peso corporal), preparar injecção mistura separadamente. </li></ol></li><li> Use conservantes e sem endotoxinas solução salina, estéril, que foi aprovado para uso humano, em 10 ml, frascos de uso múltiplo. </li><li> Utilizando uma agulha de calibre 20 (0.9 mm x 25 mm) acoplada a uma ponta luer de uma seringa de 20 ml,retirar o líquido a partir de frascos de soro fisiológico e esvaziar as seringas para um tubo cónico de 50 ml. Para ajudar a pipetagem precisa de solução salina, durante a preparação das misturas de injecção de DNA com solução salina, solução salina recolher mais do que o necessário para a injecção de todos os ratinhos na experiência. Para o experimento acima, retirar salina de 3 frascos de 10 ml (um total de cerca de 30 ml), mesmo que o valor calculado de soro necessário para a experiência é de apenas 25 ml. </li><li> Pipetar a quantidade calculada de DNA em um tubo de 50 ml diferente. Tome cuidado para não tocar no lado do tubo com o corpo da pipeta para evitar a introdução de endotoxina. De acordo com o exemplo, uma pipetagem de 250 ug de controlo e 250 ug de DNA do plasmídeo experimental em tubos cónicos separadas. </li><li> Adicionar a quantidade necessária de solução salina para o ADN utilizando uma pipeta serológica. Considerando a experiência da amostra, pipeta 12,5 ml de solução salina a cada uma das misturas mestres (experimental e controle). </li><li> Permitir todas as soluções para alcançartemperatura ambiente antes da injecção. </li></ol></li><li> Preparação de seringas <ol><li> Para cada rato, preencher um, 3 ml, a seringa luer-lock esterilizado com a mistura de ADN-salina estéril usando uma agulha de calibre 20 (0.9 mm x 25 mm). Tome cuidado para evitar bolhas de ar. Evitar o uso de seringas de volume mais elevadas que a taxa de fluxo de injecção não pode ser controlada muito bem, e é difícil de manipular as seringas maiores em um lado. Ejetar qualquer mistura DNA-salina em excesso de volta para o tubo cônico, pois isso pode ser reutilizado. </li><li> Mudar a agulha a uma estéril, agulha de calibre 27. Encha a agulha com o líquido completamente sem a introdução de bolhas de ar. Ajustar o volume da mistura de ADN-salina como calculada com base no peso do rato. </li><li> Não permita que a agulha desencapada para tocar em qualquer superfície não-estéril. Se necessário, as agulhas podem ser re-tampado, utilizando a técnica com uma só mão: coloque a tampa sobre uma superfície plana, insira a agulha sem segurar a tampa com a outra mão e pressione a agulha tampadacontra um objecto firme para fixar a tampa para a agulha. As seringas estão agora prontos para injectáveis-veia da cauda. </li></ol></li></ol> 4. Entrega DNA hidrodinâmica <ol><li> Note-se que os ratos a anestesia podem reduzir a viabilidade. Evite realizar HGD em uma sala que é muito frio, pois isso também vai reduzir a viabilidade. Se a sala tem uma temperatura ambiente de 20 ° C ou se estiver usando anestesia, coloque os ratos em uma almofada de aquecimento fixada em 37 ° C pós procedimento para evitar a perda de quaisquer animais. Se estiver usando anestesia, garantir que a boca e focinho do mouse são enquanto desobstruída na almofada de calor e observe o mouse até que recupere totalmente. Não reter água ou comida dos ratos antes de HGD. </li><li> Aqueça os ratos para dilatar os vasos sanguíneos. <ol><li> Coloque a gaiola do rato (com cama incluídos) sobre uma almofada de aquecimento durante 5 minutos de modo que a temperatura do leito é de cerca de 38-39 ° C. A temperatura deve ser baixa o suficiente para manter os ratos na almofada de calor para umperíodo prolongado. </li><li> Alternativamente, coloque o mouse em um limitador de acesso dorsal com restrição mínima. Aqueça a cauda do rato por 1 min delicadamente segurando-a com um pedaço de gaze umedecida em água morna. Permitir mouse para reposicionar, se necessário. Seque a cauda com um lenço de papel para secar. </li><li> Alternativamente, rato quente, colocando a gaiola sob uma lâmpada de calor para não mais de 2 min. Se estiver usando uma lâmpada de calor, tenha cuidado para evitar o superaquecimento do mouse. </li></ol></li><li> Grande volume de injecção na veia da cauda <ol><li> Imobilizar um acesso restrainer dorsal sobre uma superfície plana por fita laboratório. </li><li> Segurando pela cauda, ​​coloque o mouse suavemente para o limitador e insira a ficha. Usar a menor quantidade de retenção como necessário para manter a cauda imobilizada. Certifique-se de que o mouse está respirando livremente. </li><li> Se o mouse está em perigo grave a qualquer momento durante o procedimento, remova o mouse do limitador imediatamente e deixe-a descansar. </li><li> Posicione o mouse parauma das veias caudal lateral é visível. Localizar as veias caudais laterais pelo olhar directamente para baixo, para a parte traseira do rato: a linha vermelha em execução no meio da cauda é uma artéria, enquanto que as linhas azuis em ambos os lados da cauda são as veias caudais laterais. </li><li> Limpe a cauda do rato cuidadosamente com um algodão embebido em álcool. </li><li> Usando a mão não injetáveis, segure a cauda com força entre os dedos indicador e médio, de modo que a cauda passa sob o dedo indicador, mais de meio e terceiro dedos e sob o dedo mindinho. Permitir que o polegar para permanecer livre para se mover. (Figura 1A) </li><li> Com a outra mão, limpe a área a ser injetado novamente com um algodão embebido em álcool. Permitir que a área seque. </li><li> Pegue a seringa carregada com a mão-de injecção e segurá-la por barril entre o polegar e os outros quatro dígitos. Não se agarre o êmbolo. </li><li> Colocar a seringa de paralelo para a cauda com a agulha apontando para o corpo do rato eo bisel (borda inclinada) da agulha virado para cima. </li><li> Insira a agulha na veia da cauda. Continuar com a injecção apenas se a veia está localizada correctamente, o que é evidente a partir da agulha deslizante em qualquer resistência. Note-se que a profundidade de inserção da agulha é uma matéria de preferência pessoal no entanto, a inserção completa não é recomendada devido a um risco aumentado de ruptura da veia. Evite mover a agulha. </li><li> Usando o polegar da mão-holding cauda, ​​fechar-se no centro da agulha e pressione hub contra a cauda para manter a agulha na posição. Não aplique pressão extrema e não se apegar eixo da agulha, como estes irão impedir o fluxo de líquido na veia. Segurar a cauda com o dedo indicador frouxamente neste ponto de modo a não impedir a injecção (Figura 1A). </li><li> Re-posicione a mão segurando uma seringa de modo que o dedo indicador eo dedo médio estão segurando o flange eo polegar está na extremidade do êmbolo (Figure 1A). </li><li> Pressionar para baixo sobre o êmbolo de um, um movimento contínuo e de injectar o volume total de líquido em 6-8 seg. </li><li> Retire a agulha da veia e parar o sangramento aplicando pressão suave para a cauda com um tecido. </li><li> Remover mouse do limitador e local rato em uma gaiola de recuperação colocado em cima de uma almofada de aquecimento (roupa de cama deve ser 37-38 ° C). Se a sala de injeção é frio, esta etapa é fundamental para a sobrevivência do mouse. Segure a cauda do rato até que o sangramento parar completamente. </li><li> Observe o mouse por 1 hora após o parto DNA hidrodinâmico. Um período inicial de respiração ofegante e imobilidade é normal devido à arritmia temporária causada por HGD mas certifique-se que o rato mostra sinais de recuperação em cerca de 5 min. Se a respiração do mouse torna-se extremamente superficial, massageie suavemente o abdome do mouse para facilitar a respiração. Observam que a taxa de recuperação pode ser ligeiramente influenciada pela estirpe de ratinho utilizada. </li><li> Voltar ratoa gaiola de habitação e garantir que o mouse tem uma abundante oferta de alimentos e água. </li></ol></li><li> Grande volume de injeção na veia da cauda usando uma posição alternativa mão <ol><li> Coloque o mouse no limitador e se preparar para injeção seguindo os passos 4.3.1 através 4.3.5, conforme descrito anteriormente. </li><li> Descanse a mão não injetáveis ​​em uma superfície plana, com quatro dedos dobrados em um ângulo de noventa graus. Os dedos (todos excepto o polegar) deve assentar em cima uns dos outros, criando uma plataforma. Segure a cauda do rato entre o polegar eo dedo indicador (Figura 1B). </li><li> Com a outra mão, limpe a área a ser injetado novamente com um algodão embebido em álcool. Permitir que a área seque. </li><li> Agarrar a seringa com a mão-de injecção e segurá-la até ao rebordo e a extremidade do êmbolo, pronto para injecção. </li><li> Conclua o procedimento, seguindo este protocolo a partir do passo 4.3.9 até a etapa 4.3.17, conforme descrito anteriormente. </li></ol></li></ol>

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R., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primate+trypanosome+lytic+factors.">Characterization of primate trypanosome lytic factors.</a> Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).</li><li>Pays, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trypanolytic+factor+of+human+serum.">The trypanolytic factor of human serum.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).</li><li>Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+trypanosome+lytic+factor+from+human+serum.">Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum.</a> Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).</li><li>Vanhamme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+is+the+trypanosome+lytic+factor+of+human+serum.">Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum.</a> Nature. 422, 83-87 (2003).</li><li>Nielsen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haptoglobin-related+protein+is+a+high-affinity+hemoglobin-binding+plasma+protein.">Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein.</a> Blood. 108, 2846-2849 (2006).</li><li>Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosome+lytic+factor,+a+subclass+of+high-density+lipoprotein,+forms+cation-selective+pores+in+membranes.">Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes.</a> Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).</li><li>Perez-Morga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+L-I+promotes+trypanosome+lysis+by+forming+pores+in+lysosomal+membranes.">Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes.</a> Science. 309, 469-472 (2005).</li><li>Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+apolipoprotein+components+within+the+trypanosome+lytic+factor+complex+revealed+in+a+novel+transgenic+mouse+model.">Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model.</a> J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).</li><li>Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+resistance-associated+protein+blocks+lysosomal+targeting+of+trypanosome+lytic+factor+in+Trypanosoma+brucei.">Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei.</a> Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).</li><li>Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery+of+baboon+trypanosome+lytic+factor+eliminates+both+animal+and+human-infective+African+trypanosomes.">Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).</li><li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+trypanolytic+ApoL1+variants+with+kidney+disease+in+African+Americans.">Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans.</a> Science. 329, 841-845 (2010).</li><li>Tzur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+the+APOL1+gene+are+highly+associated+with+end+stage+kidney+disease+risk+previously+attributed+to+the+MYH9+gene.">Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene.</a> Hum Genet. 128, 345-350 (2010).</li><li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver.">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14, 129-137 (2007).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Quando realizada corretamente, HGD é um meio extremamente eficaz e segura de entrega transgene. Os passos críticos para o sucesso do HGD são: 1) fornecer a quantidade certa de ADN em um grande volume de veículo salino 2) na veia da cauda do rato 3) em menos de 8 segundos. Embora o próprio processo de injecção inegavelmente requer alguma destreza manual, o sucesso deste procedimento de seis segunda encontra-se frequentemente em uma preparação cuidadosa da experiência. A quantidade d...

Desde sua primeira descrição por Liu et al. E Zhang et al., Entrega gene hidrodinâmico (HGD) tornou-se uma ferramenta valiosa para estudar a função do gene em roedores sistemas modelo 1, 2. A técnica envolve a injecção rápida (5-7 segundos) de um grande volume (8-12% de peso corporal) de solução para a veia da cauda dos ratinhos a fim de facilitar a absorção de ADN de plasmídeo por as células de órgãos alvo 1, 2. Estas condições conduzem a expressão do gene robusto no fígado e menos expressão do gene no rim, baço, pulmão e coração. A injecção de 10 ug de pCMV-LacZ plasmídeo pode transfectar tanto como 40% dos hepatócitos, tornando HGD o mais eficiente, não-viral in vivo, o método de entrega de genes para uma data. Ao contrário dos portadores virais, pDNA é fácil de preparar, não provocar uma resposta imunológica no hospedeiro roedor 3 e não representa um risco para a saúde por meio da recombinação com finalvírus ogenous. Além disso, uma vez que as moléculas de ADN entregue por HGD não precisa de embalagem, este método é adequado para a entrega de cromossomas artificiais bacterianos (BAC) tão grandes como 150 kb 4. Outros tipos de moléculas que foram entregues por um método de hidrodinâmica incluem ARN 5-10, morfolinos 11, proteínas de 12, 13 e outras moléculas pequenas, 12, 14. As vantagens e desvantagens de HGD sobre outros métodos de entrega tem sido discutido em excelentes revisões na literatura 15-20 e um número de autores fornecida uma descrição detalhada do procedimento 21-23. Introduzindo transgenes em murganhos por HGD é segura e eficaz 1-3, 24 e o método tem sido utilizado com sucesso em ratos comparáveis ​​25. Com certas modificações, as experiências de prova-de-conceito foram realizadas em 26 galinhas, rabBits 27 e 28 porcos, embora, a aplicação vivo no da técnica em animais maiores continua a ser um desafio. Ao utilizar este método, uma outra limitação é comum que muitos dos vectores de expressão de mamíferos disponíveis não possuem os componentes para realizar um persistente, elevado nível de expressão do gene. Usando um plasmídeo, a expressão do gene de pCMV-Luc em órgãos alvo é evidente tão cedo quanto 10 minutos após HGD, no entanto, o elevado nível inicial, a expressão cai drasticamente, na primeira semana após a injecção 1. A expressão do transgene a longo prazo, é possível, dependendo do promotor e o intrão utilizado na criação do plasmídeo 3, 24 injecções no entanto, a manutenção da expressão de genes de alto nível geralmente requer repetidas. Por esta razão, HGD pode ser menos adequado para estudar doenças crônicas, que são resultado de exposição a longo prazo às proteínas prejudiciais ou produtos de proteína. Com estas limitações, HGD é uma ferramenta extremamente poderosa para estudar a pocial papel de um gene e o efeito de que os mutantes in vivo, bem como os efeitos terapêuticos e regulação de proteínas e para o estabelecimento de modelos animais da doença (para uma revisão, ver 15). Por exemplo, HGD pode ser utilizado para designar uma função de domínios e aminoácidos de proteínas através da introdução de várias construções de gene individualmente em ratinhos que têm os respectivos genes batido para fora. Além disso, esta técnica pode ser usada em qualquer estirpe de ratinho. Este protocolo descreve HGD em ratos com um foco sobre os aspectos técnicos necessários para alcançar a transfecção de sucesso: a inserção da agulha correta para a veia, o volume de injeção e velocidade de entrega. A aplicação deste método é demonstrado em um modelo do rato da tripanossomíase Africano, uma doença fatal dos seres humanos e de animais 29, 30. Enquanto várias espécies de tripanossomas causar doenças em animais, a maioria não pode causar a doença em humanos devido à inata complexos imunes em blood chamados fatores líticas tripanossomas (Tlfs) 29, 31, 32. Estes, lipoproteínas de alta densidade que formam poros (HDL) contêm dois, proteínas primatas específicas exclusivas:. HPR, o ligante, o que facilita a captação de FPTs em tripanossomas e APOL-I, o componente lítica 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense é capaz de infectar seres humanos, devido à expressão de uma proteína associada a resistência soro (SRA), que se liga e neutraliza humano APOL-I 34, 39. Babuíno TLF não é neutralizado por SRA, devido à sua divergente APOL-I da proteína 40. Como relatado anteriormente, utilizando um vector de expressão de mamífero (pRG977), a expressão transgénica do babuíno componentes TLF em ratinhos confere protecção contra tripanossomas humanos-infeccioso 40. Os dados representativos aqui apresentados demonstram como a entrega do gene hidrodinâmico pode ser aplicado para estudar os efeitos terapêuticos de uma proteína.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcohol Prep Wipe</td>
			<td style="width:113px;">Webcol</td>
			<td align="right" style="width:119px;">6818</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AST kit, Amplite Colorimetric</td>
			<td style="width:113px;">AAT Bioquest</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conical Tube, 50 ml</td>
			<td style="width:113px;">BD Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352070</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:113px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12362</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KimWipes</td>
			<td style="width:113px;">KIMTECH</td>
			<td align="right" style="width:119px;">34120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse Tail Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MTI RST</td>
			<td style="width:167px;">Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">pRG977 (mammalian expression vector)</td>
			<td style="width:113px;">Regeneron Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">NC9054335</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309657</td>
			<td style="width:167px;">Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice

Expressão eficiente de transgenes in vivo é de fundamental importância no estudo da função dos genes e desenvolvimento de tratamentos para doenças. Nos últimos anos, a entrega do gene hidrodinâmico (HGD) surgiu como um método simples, rápido, seguro e eficaz para a entrega de transgenes em roedores. Esta técnica baseia-se na força gerada pela rápida injecção de um grande volume de solução fisiológica para aumentar a permeabilidade das membranas celulares dos órgãos perfundidos e assim entregar o ADN em células. Uma das principais vantagens de HGD é a capacidade para introduzir os transgenes em células de mamíferos usando o DNA de plasmídeo despido (ADNp). A introdução de um gene exógeno usando um plasmídeo é minimamente trabalhoso, altamente eficiente e, ao contrário de transportadores virais, notavelmente segura. HGD foi inicialmente utilizado para entregar genes em ratos, é agora usado para proporcionar uma vasta gama de substâncias, incluindo oligonucleótidos, cromossomas artificiais, ARN, proteínas e pequenas moléculas em ratinhos, ratazanase, num grau limitado, de outros animais. Este protocolo descreve HGD em ratos e se concentra em três aspectos-chave do método que são fundamentais para realizar o procedimento com sucesso: correta inserção da agulha na veia, o volume de injeção ea velocidade de entrega. Os exemplos são apresentados para mostrar a aplicação deste método para a expressão transitória de dois genes que codificam para proteínas secretadas, primatas-específica, apolipoproteína LI (APOL-I) e proteína relacionada com haptoglobina (HPR).

O posicionamento correcto da agulha na veia da cauda do rato (conforme ilustrado na Figura 1) é um pré-requisito para o sucesso de entregar um transgene através de transfecção à base de hidrodinâmica. Muitas vezes, a parte mais difícil da técnica, no entanto, é a retenção da agulha dentro da veia da cauda, ​​sem movimento, de modo que todo o volume de injecção pode ser entregue dentro de um período de 6-8 s. Os pequenos erros durante o processo de injeção pode resultar em muito redu...

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Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Na transfecção in vivo de ADN nu por entrega de genes hidrodinâmico apresenta genes no tecido de um animal com uma resposta inflamatória mínima. Uma quantidade suficiente de produto do gene são gerados de tal forma que a função do gene e regulação, bem como a estrutura e função da proteína pode ser analisado.

Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.3K visualizações.  Hunter College, CUNY.  Na transfecção in vivo de ADN nu por entrega de genes hidrodinâmico apresenta genes no tecido de um animal com uma resposta inflamatória mínima. Uma quantidade suficiente de produto do gene são gerados de tal forma que a função do gene e regulação, bem como a estrutura e função da proteína pode ser analisado. 

Vídeo: Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.