Este trabalho foi financiado por um Projeto Wellcome Grant (078043/Z/05/Z) para ROJW

PARTE A: High-throughput crescimento de culturas bacterianas. 1. As bactérias crescem durante a noite, em 2 ml de Meio autoindução Usando placas de 24 poços <ol><li> Esterilizar as placas de 24 poços por microondas. </li><li> Inocular 1,5 ml de meio de auto-indução (Medium Overnight Express) com recém-cultivadas colônias de bactérias ou ações de glicerol congelados. Nós normalmente inocular três poços para cada mutante, com três colónias individuais clonados. Reservar seis poços para controlos positivos e negativos. Para os controlos positivos que crescem em três clones de tipo selvagem e para os controlos negativos que crescem dois clones que foram transformadas com um plasmídeo não expressar. Verificar para esterilização suficiente da placa, deixando uma cavidade em branco para o controlo do meio-only. </li><li> Cultivar as células durante 18 horas a 37 ° C e agitação a 250 rpm. Usamos lac induzível BL21 (DE3) Rosetta 2 células. Meio de auto-indução contém uma mistura de glucose e lactose. A bactéria inicialmentealimentar de glucose e em seguida começar a utilizar a lactose, o qual também induz a expressão das proteínas recombinantes. </li><li> Remover a tampa e colocar a placa na plataforma robótica. </li></ol> PARTE B: purificação de proteínas recombinantes Robótica. 2. Prepare a plataforma robótica <ol><li> Tornar-se o tampão de lavagem consistindo em 20 mM de imidazole, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, glicerol a 10%, e o tampão de eluição constituído de imidazol 0,5 M, 0,1% de Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% de glicerol. Estas memórias intermédias será usado para lavar as esferas após as proteínas marcadas foram ligados a eles, ou para eluir as proteínas a partir dos grânulos, respectivamente. </li><li> Tornar-se o diluente bacteriana (100 ml de água destilada, com 15 ul de reagente anti-espuma). Esta solução será usadapara fazer diluições das culturas bacterianas durante a noite para a densidade óptica (A600) medições. A presença de anti-espuma no diluente evita a formação de bolhas de ar que possam interferir com as medições de leitor de placa. </li><li> O volume da solução de lise composta por reagente fastbreak 10x, 2 lysonase ul por cada amostra e 15 mM MgOAc 2. Fastbreak contém uma mistura de detergentes e sais que quebrar as paredes celulares de bactérias e facilitar a liberação de proteínas intracelulares. Lysonase é uma mistura patenteada de lisozima e uma nuclease. Lisozima auxilia na ruptura da parede celular e a nuclease digere os ácidos nucleicos bacterianos libertados. </li><li> Opcional: Faça-se uma solução de cloridrato de 6 M de guanidina. Algumas proteínas recombinantes tendem a ficar com as agulhas com teflon de pipetagem. A guanidina desnatura as proteínas e solução de cloridrato de lava-los de forma mais eficaz do que a água que é rotineiramente usado para lavar as laváveis ​​robóticos dicas de pipetagem após cada ªep. </li><li> Prepare o BCA (ácido bicinconínico) reagente quantificação de proteínas por mistura de solução de ácido bicinconínico (reagente A) e da solução de sulfato de cobre (reagente B): ligações peptídicas reduzir Cu 2 + a partir do CuSO4 componente presente no reagente BCA de Cu em que 1 + a quantidade de Cu + 1 é proporcional ao número de ligações peptídicas presentes na solução. Num segundo passo, duas moléculas de ácido bicinconínico quelato de Cu 1 + resultando numa mudança de absorvância a 562 nm, o que resulta numa cor púrpura. A reação de cor é dependente do tempo e, geralmente, precisa de várias horas para ser definitiva. Depois que a cor é estável durante várias horas. </li><li> Preencha calhas ou placas do tamanho certo e colocá-los em suas posições pré-alocados na plataforma robótica. </li><li> Coloque uma placa de 24 cavidades para os resíduos de cloridrato de guanidina, duas claras placas de 96 cavidades para a OD 600 e medições de absorvância e um azul placa de 96 poços para poe proteínas purificadas sobre as suas posições sobre a plataforma. Coloque uma placa de 96 deepwell no stand magnético. </li><li> Diluir MagneHis Ni-partículas de proteínas que se ligam através da formação de quelatos com os seus His-Tag de 5 vezes em água destilada e enchê-los para a unidade de pérolas em agitação. Desligue o agitador para manter os grânulos em suspensão. </li><li> Ligue a plataforma robótica e lave as agulhas de pipetagem por vários minutos para remover as bolhas de ar que, de outra forma interferir com a precisão de pipetagem. As agulhas reutilizáveis ​​pipetagem são lavadas entre os passos de pipetagem individuais. Alternativamente, pontas descartáveis ​​podem ser utilizados. Todos os passos subsequentes são realizadas roboticamente. O protocolo de robótica está disponível mediante pedido. </li></ol> 3. Crescimento das células é verificada por medição da OD600 <ol><li> 10 ul da cultura durante a noite dilui-se em 90 ul de uma solução diluente. </li><li> Medir a OD 600 para assegurar que as bactérias cresceram até densidades semelhantes(Figura 1). </li></ol> 4. As células são quebradas para liberar as proteínas e para permitir Bead vinculativo <ol><li> 100 ul de suspensão de Ni-esfera magnética é distribuído em cada cavidade de uma placa de 24 cavidades segundo. </li><li> 900 uL de cada cultura em pequena escala bacteriano é transferido para a placa de 24 poços contendo os grânulos. Adicionar 100 ul da mistura fastbreak / lysonase 10x. </li><li> A placa de 24 poços é transferido para a plataforma de agitação para agitação rápida (800 rpm) durante 30 min à temperatura ambiente. As paredes das células bacterianas são interrompidas por uma combinação de forças mecânicas e acção química e as proteínas produzidas de forma recombinante são libertados para a solução. Com tags sua afinidade imediatamente ligar as esferas paramagnéticas de níquel quelantes. </li></ol> 5. As esferas são lavadas <ol><li> Os lisados ​​de células contendo-os grânulos em suspensão magnética são transferidos para uma placa de 96 deepwell que é posicionado sobre um suporte com mhastes agnetic que deslizam entre os poços. As placas de 96 cavidades têm uma parte inferior em forma de cone largo, que facilita a remoção do sobrenadante. As cavidades podem conter volumes de até 2,1 ml, mas são preenchidos com volumes muito pequenos. Isto permite-nos realizar vigorosos passos agitação sem amostra de contaminação cruzada por salpicos. </li><li> As pontas das pipetas são lavadas entre cada passos de pipetagem com 6 M de guanidina-HCl. Este passo é crucial para a depuração de TFIIB e outras proteínas &quot;pegajosos&quot;, para evitar a contaminação cruzada. Com outras proteínas pode ser suficiente para enxaguar as agulhas extensivamente com água, entre os passos de pipetagem. </li><li> As hastes magnéticas do suporte magnético atrair as esferas paramagnéticas, puxando-os para fora a partir dos centros dos poços e permitir que as agulhas de pipetagem livre acesso ao sobrenadante. O sobrenadante é descartado. </li><li> 500 ul de tampão de lavagem é adicionado à placa de 24 poços e subsequentemente transferido para a placa de 96 poços e paraNsure a transferência completa dos grânulos. A placa de 24 cavidades é removido do agitador. </li><li> Outra ul 500 de tampão de lavagem é adicionado directamente à placa de 96 poços, a placa foi transferida para o agitador e agitado vigorosamente durante 1 minuto. A placa é movida de volta para o suporte magnético e o tampão de lavagem descartada. </li><li> Este passo é repetido mais duas vezes e o procedimento de lavagem é terminada através da remoção de quaisquer vestígios de tampão da placa. </li></ol> 6. Eluir as proteínas em tampão de eluição <ol><li> 100 ul de tampão de eluição é adicionado aos grânulos, a placa é movida para o agitador e agitado vigorosamente durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> A placa é movida de volta para o agitador e o eluato contendo a proteína recombinante purificada, é transferida para uma nova placa. </li></ol> 7. Medir as concentrações das proteínas purificadas <ol><li> 190 ul de reagente BCA mistura é transferida para uma placa de 96 poços clara e 10 ul da protein solução adicionada. </li><li> Após várias horas de incubação (normalmente 5-6 ou durante a noite), medir a absorvância e compará-lo com os padrões de BSA para determinar as concentrações de cada uma das preparações de proteína purificada (Figura 2). </li><li> As proteínas purificadas podem agora ser usados ​​para aplicações a jusante, nas concentrações apropriadas (Figura 3). </li></ol> 8. Resultados representativos O protocolo de purificação oferece duas etapas de controlo de qualidade, exemplos dos quais são mostrados. Nós somos capazes de identificar e documentar os potenciais problemas na fase de crescimento bacteriano (Figura 1) e, mais tarde, mediante a avaliação dos rendimentos das proteínas purificadas (Figura 2). Nós normalmente purificar proteínas e testá-los em triplicado. Isto, em combinação com as duas etapas de controlo de qualidade, dá-nos a certeza de que qualquer variação foi observada nos nossos ensaios funcionais devem-se ao mutante phenotype (Figura 3) e não é causada por variações experimentais ou purificações falhadas. Os rendimentos obtidos variam tipicamente 50-200 ug e são mais do que suficientes para vários ensaios funcionais. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> Figura 1. Histograma das medições de OD de uma placa de 24 poços com culturas durante a noite. Três clones de seis TFIIB variantes mutantes, assim como do tipo selvagem TFIIB foram cultivadas. Dois clones que transportam um plasmídeo não expressar e um poço com meio apenas servem como controlos negativos. As medições de OD mostram que existem pequenas variações nas taxas de crescimento entre as diferentes culturas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> Figura 2. Rendimentos proteicos obtidos a partir destas culturas, conforme determinado por um ensaio de BCA e confirmada por SDS-PAGE. Uma das variantes não é expresso em níveis elevados. Em comcombinação com a Figura 1, pode-se concluir que esta não era devida ao crescimento celular diferencial, mas, devido à expressão da proteína não ser induzido adequadamente. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> Figura 3. Resultado representativo de um ensaio de transcrição. Medimos a actividade de estimulação de variantes TFIIB sobre a produção de pequenas transcritos abortivos por RNAP. Aqui, os efeitos de estimulação de uma biblioteca completa de substituições de um único aminoácido de TFIIB resíduo K87 são mostrados. O elevado grau de reprodutibilidade é confirmada por pequenas taxas de erro. Um gel de exemplo mostrando o desempenho de três mutantes em relação ao tipo selvagem (wt), controlos negativos (NC) e tampão de eluição apenas controla é descrito abaixo.

<ol>
	<li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain.">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li><li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+polymerase+factory:+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes.">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li><li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases.">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40 (2008).</li><li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions.">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li><li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+Function+of+TFIIB.">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , (2011).</li><li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea.">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li><li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II.">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li><li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II.">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li><li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center.">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li><li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism.">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li><li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation.">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li><li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors.">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de purificação da proteína recombinante automatizado aqui descrito permite a produção e purificação de um grande número de proteínas mutantes em um formato de pequena escala sob condições altamente reprodutíveis com uma intervenção humana mínima. Figuras 1 e 2 mostram os resultados dos controlos de qualidade-sistemáticos e exemplos do proteínas purificadas. Figura 3 mostra que os factores de transcrição purificados usados ​​neste exemplo realizar de uma maneira altamente reprodutíveis em ensaios funcionais. Mesmo que o processo foi desenvolvido para a purificação de arquea TFIIB, ele é amplamente aplicável para a purificação de proteínas marcadas com afinidade. A utilização de tais protocolos de purificação automatizados, assim, facilitar consideravelmente a análise bioquímica de proteínas recombinantes e, assim, ainda mais a nossa compreensão de interacções proteína-proteína em uma escala que é difícil de conseguir manualmente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Overnight Express Médio TB Instantânea </td><td> Merck Chemicals Ltd </td><td> 71.491-4 </td><td></td></tr><tr><td> Fastbreak </td><td> Promega Ltd. </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Reagente Lysonase Bioprocessing / 1 ml </td><td> Merck Chemicals Ltd </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> Antifoam 204 </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis Ni-Partículas </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazol </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Base Trizma </td><td> Sigma-Aldrich Compqualquer Ltd. </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Determinação de proteína do ácido bicinconínico Ácido </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Poço Profundo Placa 2,2 ml Praça Wells PP PK10 </td><td> Anachem Ltd </td><td> 1810-1800 </td><td></td></tr><tr><td> Microplaca MicroWell 96 de poliestireno de fundo bem plana não tratada 12 mangas de cinco placas de 0,4 ml de volume bem claro 128 milímetros x 86 mm Thermo Scientific Nunc </td><td> Fisher Scientific Ltd. </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> Microplaca Azul </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Bem RB blocos (24) </td><td> Qiagen </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de guanidina </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> Agulha lavável para TheOnyx </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> Reagente para a cremalheira esferas magnéticas </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> Leitor de placas Synergy HT </td><td> BioTek </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma robótica TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> Microplaca Shaker Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços Tipo Um ímã </td><td> Qiagen </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput purification of affinity-tagged recombinant proteins

Cristalografia de raios X é o método de escolha para a obtenção de uma visão detalhada da estrutura das proteínas. Tais estudos devem ser complementadas por outras análises bioquímicas para obter insights detalhados em estrutura / função relacionamentos. Avanços no oligonucleótido e tecnologia de síntese de gene tornar estratégias de mutagénese em larga escala cada vez mais viável, incluindo a substituição de resíduos alvo por todos os outros 19 aminoácidos. Ganho ou perda de função de fenótipos então permitir conclusões sistemáticas para ser elaborados, tais como a contribuição dos resíduos específicos a actividade catalítica a estabilidade da proteína, e / ou proteína-proteína especificidade interacção. De modo a atribuir diferentes fenótipos à natureza da mutação -, em vez de a variação das condições experimentais, - é vital para purificar e analisar as proteínas de uma forma controlada e reprodutível. Alto rendimento estratégias ea automação de protocolos manuais emrobóticos líquido de manipulação de plataformas criaram oportunidades para realizar tais procedimentos complexos moleculares biológicos com pouca intervenção humana e as taxas de erro mínimo de 1-5. Aqui, nós apresentamos um método geral para a purificação da His-tag proteínas recombinantes de um modo de alto rendimento. Num estudo recente, foi aplicado o método de uma investigação detalhada estrutura-função de TFIIB, um componente da maquinaria de transcrição basal. TFIIB é indispensável para o promotor da transcrição dirigida in vitro e é essencial para o recrutamento de polimerase de ARN em um complexo de pré-iniciação 6-8. TFIIB contém um domínio de ligação flexível que penetra na fenda do local activo da polimerase de ARN 9-11. Este domínio ligante confere dois bioquimicamente actividades quantificáveis ​​em TFIIB, a saber, (i) a estimulação da actividade catalítica durante a fase de &#39;abortivo&#39; de iniciação transcrição, e (ii) uma contribuição adicional para orecrutamento específica da polimerase de RNA para o pré-iniciação complexo 4,5,12. Nós explorada o método de purificação de alto rendimento para gerar substituição única, dupla e tripla e mutações deleções dentro do linker TFIIB e para posteriormente analisá-las em ensaios funcionais para o seu efeito de estimulação sobre a actividade catalítica da RNA polimerase 4. Ao todo, foram geradas, purificados e analisados ​​381 mutantes - uma tarefa que teria sido demorada e trabalhosa para executar manualmente. Nós produzimos e ensaiadas as proteínas em multiplicates que nos permitiu apreciar quaisquer variações experimentais e nos deu uma idéia clara da reprodutibilidade dos nossos resultados. Este método serve como um protocolo genérico para a purificação de proteínas marcadas com His-e tem sido utilizado com sucesso para purificar outras proteínas recombinantes. Actualmente, é optimizada para a purificação de proteínas de 24, mas pode ser adaptado para purificar até 96 proteínas.

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High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Descreve-se um método para a purificação por afinidade, marcado de proteínas recombinantes, utilizando o líquido de manipulação robótica. Este método é geralmente aplicável para a purificação de pequena escala de solúveis Sua proteínas marcadas em um formato de alto rendimento.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K visualizações.  Imperial College London. Descreve-se um método para a purificação por afinidade, marcado de proteínas recombinantes, utilizando o líquido de manipulação robótica. Este método é geralmente aplicável para a purificação de pequena escala de solúveis Sua proteínas marcadas em um formato de alto rendimento.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...