Este estudo foi financiado pelo NIH concede R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 e R01GM096187.

1. RBCs isolamento do sangue total <ol><li> Prepare EAS-45 soluções. Pesar até todos os ingredientes da Tabela I e dissolver em 100-200ml de água DI. Adicionar água para fazer a solução de 1000ml e ajustar o pH para 8,0. Filtrar e alíquota, de acordo 50ml. Congelar a -20 ° C para armazenamento. </li></ol> Nota: Passo 1.2 deve ser realizada por um médico treinado profissional, como enfermeira, com um Conselho de Revisão Institucional protocolo aprovado. <ol start="2"><li> Desenhe 3-5ml de sangue da veia cubital mediana em um tubo de 10 ml contendo EDTA e delicadamente misturar o sangue com EDTA imediata e cuidadosamente para evitar a coagulação. </li><li> Processo de amostra de sangue o mais rapidamente possível. Todos os passos a seguir, exceto centrifugação deve ser feita sob o capô para manter a preparação estéril. Transferir o sangue para um tubo de centrífuga 50ml, adicione 10 ml de Histopaque frio e estéril 1077 e centrifugar por 5 min @ 1000 rpm, 4 ° C. Repita duas vezes. </li><li> Adicionar 10ml frio e estéril PBS, centrifugue por 5min @ 1000 rpm, 4 ° C. Retire o sobrenadante. Repita 4 vezes (total de 5 vezes). </li><li> Lavar com estéril EAS-45 (5min @ 1000 rpm, 4 ° C) duas vezes. Durante os últimos RBCs mover de lavagem para um novo tubo estéril 15ml. </li><li> Ressuspender RBCs in10ml EAS-45. </li></ol> 2. Biotinilação RBCs <ol><li> Pegue o tubo com hemácias a partir do passo 1. Remover todas as sobrenadante após a centrifugação para 5min @ 1000 rpm, 4 ° C. Coloque 10μl de hemácias pellet a cada um dos vários frascos e adicionar uma quantidade correspondente de PBS a cada frasco (ver Tabela II, por exemplo, de preparação de seis diferentes concentrações de hemácias Biotinilação). </li><li> Faça novos Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 diluições de acordo com a Tabela II. </li><li> Adicionar 10μl de tampão borato 0,1 M para cada frasco. </li><li> Adicionar montante calculado de solução biotina para cada frasco (ver Tabela II como exemplo) e vortex imediatamente. </li><li> Coloque cada frasco RBCdentro de um tubo cônico de 50ml e incubar no rotador por 30min em temperatura ambiente. </li><li> Lave cada frasco 3 vezes com 800μl de EAS-45 para 2min @ 2000 rpm. </li><li> Adicionar 100μl da EAS-45 para cada frasco e armazenar a 4 ° C. Em cada 1μl da solução final deve ser agora ~ 1mln de hemácias. </li></ol> 3. Funcionalização da biotina ligada * ligantes na RBCs <ol><li> Prepare 2mg/ml solução estreptavidina de acordo com instruções do fabricante. Aliqouted solução pode ser armazenada a -20 ° C. </li><li> Misture uma quantidade igual de glóbulos vermelhos a partir do passo 2.7 (10μl) com estreptavidina solução, imediatamente vortex e incubar no rotador por 30min a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 vezes com 500μl de EAS-45 para 2min @ 2000 rpm. Adicionar 15μl EAS-45 / 1% BSA para armazenamento. </li><li> Mix igual quantidade de glóbulos vermelhos a partir do passo 3.3 (10μl) com solução de ligante 20μg/ml, imediatamente vortex e incubar no rotador por 30min em temperatura ambiente. </li><li> Lave duas vezes com 500μl de EAS-BSA 45 / 1% para 2min @ 2000 rpm. Adicionar 15μl de BSA EAS-45 / 1% para armazenamento. </li></ol> * Se sua proteína não tem nenhuma ligação biotina você pode usar um dos kits disponíveis comercialmente para Biotinilação proteína (por exemplo, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Kit Micro NHS-PEG4 Biotinilação) ou usar biotinilado anticorpos captura como um passo intermediário, como mostrado no vídeo. 4. Quantificação da densidade do receptor e ligante <ol><li> Incubar ligante revestido hemácias a partir do passo 3 e, em diferentes frasco, receptor-rolamento células com concentrações de saturação de mAbs respectivos por 30min em temperatura ambiente. Incubar em celas separadas frascos com irrelevantes isotipo pareados anticorpos para o controle. Se os anticorpos primários não são etiquetadas fluorescente, fluorescente incube com anticorpos conjugados secundários de acordo com instruções do fabricante. </li><li> Analisar amostras preparada no passo 4.1 por cytometery fluxo com correspondentes fluorescentes calbração contas. Calcular as densidades como mostrado na figura. 1. </li></ol> 5. Preparação para micropipeta e câmara de celular <ol><li> Puxe micropipetas de tubos capilares usando PN-30 Narishige &#39;Puller microeletrodos Magnetic Vidro Horizontal ou Sutter Instruments Micropipeta Puller. </li><li> Use micromanipulador com microforge para ajustar a ponta da micropipeta puxado para o tamanho desejado (geralmente o diâmetro necessário varia de 1-5m, dependendo do tamanho das células para ser utilizada no estudo). </li><li> Prepare a câmara de célula cortando tampa de vidro do microscópio para o tamanho desejado. Vedação da câmara utilizando óleo mineral de ambos os lados para evitar a evaporação média para mudar a osmolaridade durante o experimento. </li><li> Adicione a células receptoras e de suporte de ligante para a câmara. </li></ol> 6. Micropipeta ensaio de freqüência de adesão <ol><li> Aspirar as células interagindo por pipetas respectivos e uso do computador programado piezoelectr<html> Tradutor ic para conduzir o RBC dentro e fora de contato com a outra célula com área de contato controlado e tempo. Detectar eventos de adesão, observando alongamento RBC sobre separação de células. </li><li> Repetir o ciclo de contato-retração 5-10 vezes para um tempo de contato fornecido. Registrar os eventos de adesão observado pela adição de &quot;1&quot; para a adesão ou &quot;0&quot; para não adesão em uma coluna de planilha Excel. Você pode usar um dispositivo de gravação, por exemplo, a mídia digital ou fita de vídeo, para as imagens microscópicas. </li><li> Registrar a freqüência de aderência versus a curva do tempo de contato com pelo menos três pares de células diferentes para cada tempo de contato para obter uma média e SEM. </li><li> Registro da curva de inespecífica para o controle usando hemácias revestidas com ligantes irrelevantes (por exemplo BSA) e / ou bloquear os receptores ou ligantes específicos usando seus mAbs bloqueio funcional. Freqüência de adesão específicas em cada ponto de tempo de contato pode ser calculado pela remoção da freqüência de adesão inespecífica 1. </li></ol>ove_title &quot;análise&gt; 7. Dados <ol><li> Fit a freqüência específica de adesão P uma relação de contato de dados em tempo t por um modelo probabilístico (Equação 1) que descreve uma segunda ordem para a frente e de primeira ordem inversa, a interação de um único passo entre uma única espécie de receptores e uma única espécie de ligantes um : <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" /> onde K a é a afinidade de ligação eficaz 2D, k off é o desconto na tarifa, m r e m l são os respectivos receptores e densidades ligante medida no passo 4, e A c é a área de contato. A curva de ajuste tem dois parâmetros, A c K a k e fora, como um C e um K são agrupados e chamados coletivamente como afinidade 2D eficaz. Seu produto com o desconto na tarifa é a taxa efetiva 2D-on: A </em&gt; c k = A em c K a k x off. A freqüência específica de adesão P a é calculado pela subtração da fração de adesão inespecífica (P inespecíficos) da adesão total medidos (medidos P) 1,21: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" /></li></ol> 8. Resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" /> Figura 1 Determinação da integrina β 2 L α densidade site em neutrófilos. Neutrófilos foram primeiro incubadas com 1μg/ml de E-selectina-Ig de 10min para coincidir com a condição experimental utilizada nas Figuras 3,4 ou sem E-selectina-Ig, e depois com as concentrações de saturação (10μg/ml) de conjugado anti-PE -humano CD11a mAb (Clone HI111, consulte a Tabela de específicasreagentes e equipamentos) ou rato IgG1 irrelevante para controle, lavados, e analisadas imediatamente. As amostras foram lidas no citômetro de fluxo BD LSR com o padrão QuantiBRITE contas calibração PE. Um painel mostra os histogramas de fluorescência de contas de calibração (rosa), juntamente com os de E-selectina-Ig células tratadas (cor azul) ou sem tratamento (cor verde). Específicas CD11a coloração mAb é mostrado nas curvas de sólidos e coloração do anticorpo irrelevante isotipo controle pareados é mostrado nas curvas pontilhadas. Células tratadas com E-selectina-Ig (presença em todas as etapas de lavar e em tampão FACS) não afetou a densidade CD11a como pode ser visto a partir da comparação com células não tratadas. Painel B mostra o processo de quantificação de densidade. Log10 foi calculado para a intensidade média fluorescente (FI) de cada valor de pico de quatro histogramas talão de calibração a partir do Painel A (círculos cor de rosa) e para as moléculas muito específicas PE por talão (do fabricante). Uma regressão linear de moléculas Log10 PE por talão contra Log10 fluoresccia foi plotada. Por E-selectina células tratadas a Log10 FI (y) valores iguais 3,99 (círculo sólido azul) e 2.23 (círculo aberto azul) para mAb específico e anticorpo controle, respectivly. Resolvemos a equação linear de x (os valores são representados como círculos verde e azul no painel B) x = Log10 PE / célula e, como PE:. MAb proporção de 1:1, o número total de α β L 2 em neutrófilos foi calculado como 9587. Densidade de superfície foi calculada em 43 moléculas / M 2, usando 8.4μm como o diâmetro de neutrófilos 22. Densidade de ICAM-1 foi igualmente medido pelo cytometery de fluxo, utilizando-PE anti-CD54 humano mAb, que igualou 65 mol / M 2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" /> Figura 2 sistema de esquemas Micropipeta. Nosso sistema de micropipeta foi montado em casa e é composto por três subsistemas: um subsistema de imagem para permitir que se observe, record e analisar os movimentos da célula micropipeta de aspiração; um subsistema de micromanipulação para habilitar uma para selecionar as células da câmara de célula, e um subsistema de pressão para permitir uma para aspirar as células em micropipetas. A peça central do subsistema de imagem é invertida microscópio (Olympus IMT-2 IMT2) com um óleo de imersão 100x 1,25 NA objetivo. A imagem é enviada para um gravador de vídeo através de um dispositivo casal de carga (CCD) da câmera. Um temporizador de vídeo é acoplado ao sistema para manter a noção do tempo. Cada micropipeta pode ser manipulado por um acionamento mecânico montado no microscópio e finamente posicionado com um micromanipulador de três eixos hidráulicos. Manipuladores mecânicos de Newport poderia ser usado também. Um dos titulares micropipeta é montado em um tradutor piezoelétrico, o condutor de que é controlado por um computador LabView código (disponível a pedido) e os traduz sinal através de uma placa DAQ através de um amplificador de tensão (caseiro) para o atuador piezo. Este umllows um para mover a pipeta de forma precisa e repetidamente em um ciclo de teste de aderência. O subsistema de regulagem de pressão é usado para controle de sucção durante o experimento. A linha hidráulica conecta o titular micropipeta para um reservatório de fluido. Um posicionador fino mecânica permite que a altura do reservatório a ser manipuladas com precisão. Micropipetas são gerados usando a fusão KIMAX ponto de tubos de vidro borossilicato capilar (com diâmetro externo de 1,0 ± 0,07 mm e um diâmetro interno de 0,7 ± 0,07 mm. Primeiro, o micropipetas de tubos capilares são puxados usando PN-30 Narishige &#39;Puller microeletrodos Magnetic Vidro Horizontal (Sutter Instruments Micropipeta Puller é outra opção extrator). Em segundo lugar, o sistema Microforge (construído em casa) é usado para cortar o micropipetas para a abertura tamanho desejado. Commercial modelos de sistemas de Microforge também estão disponíveis. Para evitar a vibração do micropipetas durante o experimento, o Microscope, juntamente com o micromanipuladores, é colocado em uma mesa de suspensão a ar. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" /> Figura 3 Executando F freqüência de adesão específica para i (A) e inespecíficos (B) ligação em 1s (vermelho) e 10s vezes (azul) de contato medido a partir de ciclos repetidos de adesão de teste entre hemácias revestidas com ICAM-1 (A) ou hIgG (B ) com neutrófilos humanos expressando integrina α β L 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), onde i é o índice de ciclo de teste, X i é igual a &quot;1&quot; (aderência) ou &quot;0&quot; (sem adesão). F n (n = 50) foi usado como a melhor estimativa para a probabilidade de adesão. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" /> Figura 4 Cinética deICAM-1 vinculativo para neutrófilos integrina β L α 2 ( <img alt="Quadrado" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" /> ). Probabilidade de adesão, como indicado na Figura 3 para três pares de células em cada tempo de contato é média e plotados versus tempo de contato. O meio de câmara foi HBSS com 1mm de cada um de Ca 2 + e Mg 2 +, mais 1μg/ml dimérica de E-selectina-Ig para upregulate α β L 2 vinculativo. Para capturar ICAM-1-Ig de hemácias, uma etapa intermediária foi adicionado para incubar hemácias com anticorpos de captura de 10μg/ml (biotinilado de cabra anti-anticorpo humano Fc, eBioscience) após a etapa de incubação estreptavidina. Para controlar inespecífica duas condições diferentes foram utilizados: 1) hemácias revestidas com o anticorpo de captura anti-humano Fc e incubadas com IgG humana em vez de ICAM-1-Ig (O) e 2) neutrófilos ligação a eritrócitos não revestidos com o captura de anticorpos (Δ). 10μg/ml IgG humana foi adicionadas ao meio de minimizar ligação de E-Selectina-Ig em solução para o anticorpo de captura na superfície RBC. Ligação não específica registrada como curva de controle humano IgG foi utilizado para obter uma curva de probabilidade específica de adesão ( <img alt="Quadrado" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" /> ) Usando a equação. 2. Curva de probabilidade de montagem específicas de adesão com a Eq.. 1 (linha contínua) retornou afinidade de ligação eficaz A K c a = 1,4 • 10 -4 e μm4 k off = 0,3 s -1. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> MW (g / mol) </th><th> Concentração (mM) </th><th> Quantidade (g) </th></tr><tr><td> Adenina </td><td> 135,13 </td><td> 2 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td> D-glicose (dextrose) </td><td> 180,16 </td><td> 110 </td><td> 19,82 </td></tr><tr><td> D-Manitol </td><td> 182,17 </td><td> 55 </td><td> 10,02 </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> 58,44 </td><td>50 </td><td> 2,92 </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico (Na HPO ) </td><td> 141,95 </td><td> 20 </td><td> 2,84 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> 146,15 </td><td> 10 </td><td> 1,46 </td></tr></tbody></table> Preparação tabela 1. EAS-45 buffer (1L). <table border="1"><tbody><tr><td> 25 mg biotina-XHS em 550 mL de DMF </td><td> 0,1 M solução de biotina </td></tr><tr><td> Diluição de 1:10 de 0,1 biotina w / DMF </td><td> 0,01 M solução de biotina </td></tr><tr><td> Diluição 1:100 de 0,1 biotina w / DMF </td><td> 0,001 m solução de biotina </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Preparação da solução de biotina. <table border="1"><tbody><tr><th> biotina concentração final (M) </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td> RBCs pellet de ações (mL) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1x PBS (mL) </td><td> 179,2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176,8 </td></tr><tr><td> 0,1 M de borato tampão (mL) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0,01 M biotina solução (mL) </td><td></td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3,2 </td></tr><tr><td> 0,001 m biotina solução (mL) </td><td> 0,8 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. Biotinilação de hemácias.

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Physiol. 69, 1767-1778 (1990).</li><li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+Fcgamma+receptor+IIIa+(CD16a)+binding+to+IgG+ligands.">Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands.</a> J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).</li><li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces:+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods.">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).</li><li>Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+binding+of+fibroblasts+to+fibronectin:+optical+tweezers+experiments+and+probabilistic+analysis.">Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis.</a> Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).</li><li>Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+horizontal+force+probe+for+mechanical+tests+on+pipette-held+cells,+particles,+and+membrane+capsules.">Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules.</a> Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).</li><li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation.">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophys. J. 74, 492-513 (1998).</li><li>Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+competition+binding+between+soluble+and+membrane-bound+ligands+for+cell+surface+receptors.">Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors.</a> Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).</li><li>Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+modeling+of+rosette+formation.">Probabilistic modeling of rosette formation.</a> Biophys. J. 91, 352-363 (2006).</li><li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge.">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li><li>Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+governs+flow-enhanced+cell+tethering+through+L-selectin+at+threshold+shear.">Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear.</a> Biophys. J. 92, 330-342 (2007).</li><li>Evans, E., Berk, D., Leung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+of+agglutinin-bonded+red+blood+cells.+I.+Forces+to+rupture+molecular-point+attachments.">Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments.</a> Biophys. J. 59, 838-848 (1991).</li><li>Zarnitsyna, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion.">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para usar com sucesso o ensaio de micropipeta freqüência de adesão deve-se considerar várias etapas críticas. Primeiro, certifique-se de registrar a interação específica para o sistema de receptor-ligante de interesse. Medidas de controle não-específica (cf. fig. 3, 4) garantir a especificidade. Idealmente, as probabilidades de adesão não específica deve ser inferior a 0,05 para todas as durações de tempo de contato e ter uma diferença significativa entre as probabilidades de adesão específicas e não ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Catálogo # </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> BioWhittaker </td><td> 17-517Q </td><td> Diluir a 1x com água deionizada antes do uso </td></tr><tr><td> Vacutainer EDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td> Isolamento RBCs </td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 10771 </td><td> Isolamento RBCs </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2786 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> D-glicose (dextrose) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> D-Manitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 6360 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico (Na &amp; # x2082; HPO ₄) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5763 </td><td> EAS-45 de preparação </td></tr><tr><td> Biotina-X-NHS </td><td> Calbiochem </td><td> 203188 </td><td> Biotinilação RBCs </td></tr><tr><td> Dimetilformamida (DMF) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 20673 </td><td> Biotinilação RBCs </td></tr><tr><td> Borato tampão (0,1 M) </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 11455-90 </td><td> Biotinilação RBCs </td></tr><tr><td> Estreptavidina </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21125 </td><td> Ligante funcionalização </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0336 </td><td> Ligante funcionalização </td></tr><tr><td> Beads Quantibrite PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340495 </td><td> Quantificação da densidade </td></tr><tr><td> Citômetro de fluxo </td><td> BD Immunocytometry Sistemas </td><td> BD LSR II </td><td> Densidade quantificação </td></tr><tr><td> Tubo capilar 0.7-1,0 milímetros x 30 &quot; </td><td> Kimble Glass Inc. </td><td> 46.485-1 </td><td> Micropipeta puxando </td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2629-1 </td><td> Câmara de montagem </td></tr><tr><td> Tampa de vidro de microscópio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-G </td><td> Câmara de montagem </td></tr><tr><td> PE α-humano CD11a Clone HI 111 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0119-71 </td><td> Reagente para Fig.1 </td></tr><tr><td> PE anti-CD54 humano </td><td> eBioscience </td><td> 12-0549 </td><td> Reagente para Fig.1 </td></tr><tr><td> IgG1 Isotype Controle PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-4714 </td><td> Reagente para Fig.1 </td></tr><tr><td> micromanipulador hidráulico </td><td> Narishige </td><td> MO-303 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> Manipulador mecânico </td><td> Newport </td><td> 461-xyz-m, SM-13, DM-13 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> Tradutor piezoelétrico </td><td> Physik Instrumente </td><td> P-840 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> Versão 8.6 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> DAQ bordo </td><td> National Instruments </td><td> USB-6008 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> Tabela óptica </td><td> Cinética de Sistemas </td><td> 5200 Series </td><td> Micropipeta sistema </td></tr></tbody></table>

adhesion frequency assay for in situ kinetics analysis of cross-junctional molecular interactions at the cell-cell interface

O ensaio de adesão micropipeta foi desenvolvido em 1998 para medir a duas dimensões (2D) receptor-ligante cinética de ligação 1. O ensaio utiliza uma célula vermelha do sangue humano (RBC) como sensor de adesão e apresentar célula de uma das moléculas que interagem. Ela emprega micromanipulação para trazer o RBC em contato com outra célula que expressa a molécula de interagir com outras área controlada com precisão e tempo para permitir a formação de vínculo. O evento de adesão é detectado como alongamento RBC em cima puxando as duas células separadas. Ao controlar a densidade dos ligantes imobilizados na superfície RBC, a probabilidade de adesão é mantido em mid-range entre 0 e 1. A probabilidade de adesão é estimada a partir da freqüência de eventos de aderência em uma seqüência de ciclos de repetição do contato entre as duas células de um determinado tempo de contato. Variando o tempo de contato gera uma curva de ligação. Montagem de um modelo probabilístico para o receptor-ligante reação cinética de 1 a a ligaçãocurva retorna a afinidade 2D e desconto na tarifa. O teste foi validado usando interações de receptores Fcγ com IgG Fc 1-6, selectinas com ligantes glicoconjugada 6-9, integrinas com ligantes 10-13, homotypical caderina vinculativo 14, T receptor celular e co-receptor com complexos peptídeo-major de histocompatibilidade 15 - 19. O método tem sido utilizado para quantificar os regulamentos da cinética 2D por fatores biofísicos, tais como a membrana microtopology 5, membrana âncora 2, orientação molecular e comprimento 6, rigidez transportadora 9, 20 curvatura, e força impingement 20, bem como os fatores bioquímicos, tais como moduladores do microambiente citoesqueleto e membrana onde as moléculas interagem e reside na organização superfície dessas moléculas 15,17,19. O método também foi usado to estudo a ligação simultânea de dupla receptor-ligante 3,4 espécies e interações trimolecular 19 usando um modelo modificado 21. A principal vantagem do método é que ele permite estudo de receptores de membrana em seu ambiente nativo. Os resultados poderiam ser muito diferentes daqueles obtidos com receptores purificada 17. Ele também permite estudo das interações receptor-ligante em uma escala de tempo sub-segundo, com resolução temporal muito além dos métodos típicos bioquímicos. Para ilustrar o método de freqüência de adesão micropipeta, mostramos a cinética de medição da molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) em hemácias funcionalizados ligação a integrina β α L 2 em neutrófilos com dimérica E-selectina na solução para ativar α β L 2.

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

adhesion-frequency-assay-for-situ-kinetics-analysis-cross-junctional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

14.9K visualizações.  Georgia Institute of Technology. Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Bioengenharia

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and higher throughput. The incorporation of biological components onto biological microelectromechanical systems (bioMEMS) has shown great potential for achieving these goals. Microfabricated electronic chips allow for micrometer-scale features as well as an electrical connection for sensing and actuation. Functional biological components give the system the capacity for specific detection of analytes, enzymatic functions, and whole-cell capabilities. Standard microfabrication processes and bio-analytical techniques have been successfully utilized for decades in the computer and biological industries, respectively. Their combination and interfacing in a lab-on-a-chip environment, however, brings forth new challenges. There is a call for techniques that can build an interface between the electrode and biological component that is mild and is easy to fabricate and pattern.
Biofabrication, described here, is one such approach that has shown great promise for its easy-to-assemble incorporation of biological components with versatility in the on-chip functions that are enabled. Biofabrication uses biological materials and biological mechanisms (self-assembly, enzymatic assembly) for bottom-up hierarchical assembly. While our labs have demonstrated these concepts in many formats 1,2,3, here we demonstrate the assembly process based on electrodeposition followed by multiple applications of signal-based interactions. The assembly process consists of the electrodeposition of biocompatible stimuli-responsive polymer films on electrodes and their subsequent functionalization with biological components such as DNA, enzymes, or live cells 4,5. Electrodeposition takes advantage of the pH gradient created at the surface of a biased electrode from the electrolysis of water 6,7,. Chitosan and alginate are stimuli-responsive biological polymers that can be triggered to self-assemble into hydrogel films in response to imposed electrical signals 8. The thickness of these hydrogels is determined by the extent to which the pH gradient extends from the electrode. This can be modified using varying current densities and deposition times 6,7. This protocol will describe how chitosan films are deposited and functionalized by covalently attaching biological components to the abundant primary amine groups present on the film through either enzymatic or electrochemical methods 9,10. Alginate films and their entrapment of live cells will also be addressed 11. Finally, the utility of biofabrication is demonstrated through examples of signal-based interaction, including chemical-to-electrical, cell-to-cell, and also enzyme-to-cell signal transmission. 
Both the electrodeposition and functionalization can be performed under near-physiological conditions without the need for reagents and thus spare labile biological components from harsh conditions. Additionally, both chitosan and alginate have long been used for biologically-relevant purposes 12,13. Overall, biofabrication, a rapid technique that can be simply performed on a benchtop, can be used for creating micron scale patterns of functional biological components on electrodes and can be used for a variety of lab-on-a-chip applications.

This article describes a biofabrication approach: deposition of stimuli-responsive polysaccharides in the presence of biased electrodes to create biocompatible films which can be functionalized with cells or proteins. We demonstrate a bench-top strategy for the generation of the films as well as their basic uses for creating interactive biofunctionalized surfaces for lab-on-a-chip applications.

Colmatar a interface Bio-eletrônico com Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de perfusão da placenta humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

Desenvolvimento de Amelogenina-quitosana Hidrogel para<em&gt; In Vitro</em&gt; Esmalte Regrowth Com uma interface Densa

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The KYF-Pt-NE encapsulates Pt(II) at 10 wt. %, has a diameter of 107 &#177; 27 nm and a negative surface charge. The KYF-Pt-NE is stable in water and in serum, and is biologically active. The conjugation of a fluorophore to KYF allows the synthesis of a fluorescent nanoemulsion that is suitable for biological imaging. The synthesis of the nanoemulsion is performed in an aqueous environment, and the KYF-Pt-NE forms via self-assembly of a short KYF peptide and an oleic acids-platinum(II) conjugate. The self-assembly process depends on the temperature of the solution, the molar ratio of the substrates, and the flow rate of the substrate addition. Crucial steps include maintaining the optimal stirring rate during the synthesis, permitting sufficient time for self-assembly, and pre-concentrating the nanoemulsion gradually in a centrifugal concentrator.

This protocol describes an efficient method to synthesize a nanoemulsion of an oleic acids-platinum(II) conjugate stabilized with a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) tripeptide. The nanoemulsion forms under mild synthetic conditions via self-assembly of the KYF and the conjugate.

Uma Nanoemulsão estabilizada tripeptídeo de ácido oleico

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Análise mecânica dinâmica ambiental para prever o comportamento de amaciamento de implantes neurais

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

Micromatrizes de biopartículas para análise quimiotática e molecular de swarming de nêutrons humanos in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

Protocolo de injeção de lipidico para medições de cristalografia serial no Síncrotron Australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Análise constante da mola molecular por espectroscopia da sonda de força biomembrana

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...