Este protocolo ajuda a estabelecer a conexão entre a força molecular e o comportamento de rolagem celular, além de permitir mapear espacialmente e quantificar a adesão ao rolamento no nível molecular. Esta técnica permite estudar eventos de adesão individual durante o rolamento celular real, permitindo medir diretamente a força de adesão molecular relevante fisiológica. A preparação da superfície usando o tempo de concentração e incubação adequado em cada etapa é crucial para alcançar a funcionalidade de superfície de alta qualidade.
A qualidade das bioconjugações e as condições adequadas também são cruciais. A demonstração visual é fundamental para ajudar os pesquisadores a replicar esse protocolo. Em particular, as etapas como a montagem da câmara de fluxo e imagens pós-processamento se beneficiarão muito de uma demonstração visual.
Comece espalhando uma pequena quantidade de epóxi em ambos os lados da fita de dois lados com uma lâmina de barbear. Usando um laser, corte a fita revestida de epóxi para criar quatro canais. Crie o chip de fluxo sanduitando a fita epóxi entre um slide de quatro buracos e uma mancha de cobertura PEG.
Usando uma ponta de pipeta, aplique pressão suave ao longo do comprimento dos canais para criar uma boa vedação e, em seguida, cure o epóxi por um mínimo de uma hora. Alinhe o chip para que a abertura de cada canal esteja posicionada nos centros do adaptador. Em seguida, coloque dois espaçadores acrílicos transparentes em cima do chip.
Aplique pressão firme no meio do bloco e parafuso nas extremidades de cada espaçador. Enrosque as entradas nos orifícios roscados do outro lado do suporte e monitore a condição de vedação através do bloco acrílico transparente. Flua 200 microliters de tampão de lavagem na câmara para verificar se há vazamento.
Se as bolhas se formarem no canal, empurre agressivamente mais 200 microliters de tampão de lavagem para remover as bolhas. Adicione 40 microliters de BSA à câmara de fluxo para evitar a ligação inespecífica e incubar por 10 minutos na câmara de umidade. Após a incubação, adicione 40 microliters na Tween 20 à câmara de fluxo e incuba novamente por 10 minutos para reduzir ainda mais a ligação inespecífica.
Em seguida, lave o canal com 200 microliters de tampão de lavagem para remover todos os agentes de passivação. Para a funcionalização da superfície da câmara, adicione 40 microliters de Streptavidin à câmara de fluxo e incuba por 20 minutos, depois lave a câmara com 200 microliters de tampão de lavagem. Agora, adicione 40 microliters de proteína hibridizada G-TGT à câmara de fluxo e incubar por 20 minutos.
Depois de lavar com tampão de lavagem, adicione 40 microliters de proteína G-TGT top strand e incuba por 20 minutos para completar qualquer fio inferior TGT não higiido na superfície e depois lave com tampão de lavagem. Por fim, adicione 40 microliters de P-selectin-Fc à câmara de fluxo e incubar por 60 minutos antes de lavar com tampão de lavagem. Encha uma seringa de vidro de cinco mililitros com o tampão de rolamento e toque nas laterais da seringa para desalojar e empurrar as bolhas para fora enquanto flutuam em direção à ponta.
Depois de inserir uma agulha estéril em um pedaço de tubo de polietileno de 200 milímetros, conecte a agulha à seringa de vidro. Fixar a seringa na bomba de seringa e inclinar a bomba de seringa de tal forma que o lado do êmbolo seja elevado para evitar que bolhas de ar entrem no canal. Insira a extremidade do tubo na entrada da câmara de fluxo.
Insira uma extremidade de outra peça de 200 milímetros da tubulação de polietileno na tomada e submerse a outra extremidade em um béquer de resíduos. Pegue de um a dois mililitros da amostra de suspensão celular e centrífuga para pelotar as células. Remova o meio e levemente resuspenque as células em 500 microliters do buffer de rolamento.
Desconecte cuidadosamente o tubo das entradas e a saída e pipeta 40 microliters da suspensão celular na câmara de fluxo. Reconecte a tubulação como descrito anteriormente, garantindo que as bolhas não sejam introduzidas no canal de fluxo. Inicie o experimento de rolagem celular iniciando a bomba de seringa nas taxas de fluxo desejadas.
Observe o rolamento de células usando um microscópio de campo escuro com um objetivo de 10X. Uma vez que o experimento seja concluído, remova as células do canal infundindo o tampão de rolamento a 100 mililitros por hora até que a superfície esteja livre de células. Para a imagem das faixas locais por DNA-PAINT, adicione 40 microliters de fio imager DNA-PAINT preparado em buffer DNA-PAINT ao canal.
Realize microscopia de fluorescência de reflexão interna total utilizando as condições mencionadas no manuscrito do texto. Localize e torne as imagens de super resolução. Para fotografar as faixas longas por rotulagem permanente, adicione o fio imager permanente e incubar por 120 segundos no buffer T50M5.
Em seguida, lave o canal infundindo 200 microliters de tampão de lavagem. Grave uma imagem com o laser de excitação desligado para obter ruído de câmera de fundo. Imagem uma grande área em um padrão de grade pela microscopia TIRF.
Programe o microscópio para digitalizar a área de 400 por 50 imagens e divida os dados brutos em arquivos TIP individuais cada um contendo um máximo de 10.000 imagens usando o programa ImageJ. Achate todas as imagens usando o perfil de iluminação e use o plugin MIST para costurar as imagens. O resultado para a caracterização da bioconjugação da proteína G ssDNA mostrou que quase uma é uma razão de proteína G para ssDNA onde a proteína G Maleimide ssDNA e espectro tampão de eluição imidazol da base ortogonal para a montagem do espectro do produto de bioconjugação.
Native PAGE foi usado para confirmar a bioconjugação mostrando as bandas verdes brilhantes coincidindo com a banda de proteína monomérica G indicando conjugação bem sucedida e bom rendimento. O perfil de iluminação TIRF introduzido a partir de uma fibra de modo único é geralmente mais brilhante no meio do campo de visão e dimmer ao redor das bordas. Para compensar a iluminação desigual e achatar as imagens para análise quantitativa, o perfil de iluminação foi determinado pela média de milhares de quadros individuais.
As imagens achatadas foram produzidas subtraindo o ruído da câmera tanto de perfis brutos quanto de iluminação e, em seguida, normalizando pelo perfil de iluminação. A costura bruta mostrou padrões periódicos claros correspondentes às imagens não corrigidas, enquanto o mesmo campo de visão costurado a partir de imagens achatadas produziu um fundo plano. Um perfil de fluxo de rampa foi usado para determinar a amplitude de estresse da cisalhamento que resultou em rolagem celular e fluxo de fluorescência sob as quais uma pegada típica de adesão unicelular poderia ser vista.
Resultados subótimos e ótimos de trilhas fluorescentes com contraste insuficiente, densidade excessiva da faixa, densidade e contraste da pista ideais e difusão limitada e imagem DNA-PAINT são mostrados. O tempo de incubação superior a 60 minutos garante a funcionalização da superfície e a construção adequada da câmara impede a passagem de bolhas que danificam a superfície funcionalizada. Este procedimento é aplicável para análise quantitativa da força molecular envolvida na adesão ao rolamento e permite que os pesquisadores entendam o comportamento de rolagem dos diferentes tipos celulares.
Essa técnica permite que os pesquisadores explorem novas questões sobre eventos de adesão rápida que levem a um avanço da pesquisa de molécula única e mecanobiologia.
