Agradecemos a RIKEN para financiamento. P10-Gal4 foi um presente tipo de Alain Vincent (Université Paul Sabatier, Toulouse, França).

1. Preparação de reagentes Notas antes de começar: dissecção e coloração imuno-histoquímica são realizadas em uma câmara magnética ea larva é preso utilizando os pinos de insetos com formato especial. Instruções detalhadas sobre a construção de uma câmara magnética, ea preparação desses pinos pode ser encontrada nas referências relacionadas 14,15. Em resumo, um buraco quadrado 1x1cm é cortada em uma folha magnética e uma lamela afixada na parte traseira da folha para fazer uma pequena câmara. Os lados da câmara são selados com cola epóxi, após esta cola não definiu a câmara é lavado várias vezes com etanol 70% antes de usar. Pinos de insetos dissecção são preparados por flexão na forma requerida e então colados em uma guia de metal 14,15. Em alternativa a uma guia de metal, temos utilizado uma invertida de cabeça chata pin desenho de aço com uma alça feita a partir de uma ponta de corte amarela. O uso deste arranjo câmara magnética permite fechar controle over posicionamento do pino e do tecido que se estende durante a dissecção. Para dirigir a expressão do gene repórter em subconjuntos diferentes de investigadores DA neurônios pode usar várias linhas diferentes Gal4 (resumido por Shimono e colegas 16). Muitas dessas linhas estão disponíveis em centros de estoque público. Neste protocolo representante, realizamos imunocoloração de uma linha em que duas classes contrastantes de DA neurônio são co-marcado: o mais simples de classe I e mais complexo de classe IV (P10-Gal4 17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-Orange (KO)). <ol><li> Prepare Ca + + livre HL3.1 salina <ol><li> Em mM: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sacarose, trealose e 5; pH 7,2 19. Filtro-esterilizar e armazenar a 4 ° C. Nota: Ca + + livre solução impede a contração muscular durante a dissecção. </li></ol></li><li> Prepare tampão PHEM 2x <ol><li> Em mM: 130 PIPES, HEPES 60, 20 EGTA, 4 MgSO4; pH 7,0. Filtro-esterilizar e armazenar a 4 ° C. Nota: Estes materiais não se dissolvem até que a aproximação do pH 7.0. </li></ol></li><li> Prepare o fixador recém imediatamente antes da fixação. <ol><li> A fim de preparar uma solução de 25ml, paraformaldeído 2g primeiro mix, 100μl 1M NaOH e água 10ml em tubo Falcon 50ml. </li><li> Agite fixador em um banho de água 55 ° C, com agitador até que a solução é clara. (Volume total será de cerca de 11,5 ml.) </li><li> Fixador fresco no gelo. </li><li> Adicionar 12.5ml tampão PHEM 2x. </li><li> Ajustar o pH para 7,0 com HCl 1M. </li><li> Preencha a solução com água até que o volume é 25ml. </li><li> Filtrar a solução usando papel Whatman. </li></ol></li></ol> 2. Dissecação das larvas Nota antes de começar: redes de microtúbulos, e em particular os dendritos sensorial, vai colapso rapidamente após o início da dissecção. CAhieving dissecção rápida em menos de cinco minutos, seguida pela fixação imediata são fatores chave para o sucesso deste protocolo. <ol><li> Lavar a larva na água e rapidamente movê-los para essa queda usando um laço de cabelo. </li><li> Orientar a larva até lado dorsal e no lado ventral no vidro. Nota: Esta orientação é examinar os neurônios aglomerado ventral. Para examinar os neurônios aglomerado dorsal, inverter a orientação. </li><li> Utilizar o centro de insetos pino a pino a extremidade anterior perto da boca ganchos. Coloque o pino perto do fim para obter melhores resultados. </li><li> Coloque uma gota de solução salina HL3.1 na câmara de dissecção. </li><li> Cortar a ponta posterior da larva fora com microtesoura. Nota: Este passo abre uma abertura na parte posterior da larva que irá permitir o acesso para a microtesoura (passo 2.7). </li><li> Pegar com a pinça a região do intestino que agora está saindo da abertura na extremidade posterior da larva. Retire cuidadosamente o intestino todo. </li><li> Coloque oponta de uma lâmina do microtesoura através da abertura e corte ao longo da linha mediana ventral para o anterior. </li><li> Utilizando os pinos de canto, pinos nos cantos agora livre, posterior primeiro, depois anterior. Simultaneamente esticar suavemente abrir o filé larval. </li></ol> 3. Fixação, o bloqueio, coloração e montagem de filetes larval Notas antes de começar: Todos os passos de fixação e coloração são realizadas na câmara de dissecção. Durante este processo, tome cuidado para não bater os pinos de insetos segurando a larva, pois isso pode levar a danos nos tecidos. Para evitar a experiência de secar, faça todos os passos coloração em um recipiente Tupperware pequena, rodeada por lenços umedecidos. <ol><li> Aspirar o Ca + + livre HL3.1 buffer usando uma ponta amarela. Imediatamente adicione o fixador usando outro pipetteman. </li><li> Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar o fixador com os traços remanescentes de Ca + + livre HL3.1 tampãona câmara. Imediatamente aspirado-lo e em seguida, adicione fixador fresco para dentro da câmara. </li><li> Incubar à temperatura ambiente por 20 minutos. </li><li> Lavar 10mins 6x no PBST (0,1% Triton X-100 em PBS). </li><li> Bloco com soro de cabra 5% em PBST por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Substitua a solução de bloqueio com anticorpos primários diluídos em soro de cabra 5% em PBST. Os anticorpos primários utilizados são mouse anti-α-tubulina (DM1A) e de ratos anti-CD8 (5H10) ambos diluídos a 1 / 1000. Nota: O investigador pode desejar substituir o rato tubulina anti-α-(DM1A) com o mouse anti-Futsch (22C10) 20,21 diluído 1 / 1000, em algumas circunstâncias (ver discussão). </li><li> Incubar overnight (por pelo menos 16h) a 4 ° C. </li><li> Lavar 10mins 6x no PBST. </li><li> Adicionar solução de anticorpo secundário diluído em soro de cabra 5% em PBST. Os anticorpos secundários utilizados são Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG e Cy3 burro anti-rato IgG. Manter a amostra coberta para evitar fluoróforofoto-branqueamento 22. </li><li> Incubar quer no RT por duas horas, ou durante a noite a 4 ° C seguido por uma hora em temperatura ambiente. </li><li> Lavar 10mins 6x no PBST. </li><li> Coloque o filé larval no slide cutícula voltada para baixo, montado em glicerol 80%, e selar os lados da lamela com unha polonês para uma montagem de &#39;quick&#39;. Nota: Para limpar o tecido melhorou, e uma amostra permanente e estável, montagem em DPX como descrito anteriormente 23. </li></ol> 4. Resultados representativos: Fluorescente de coloração foi analisada sob um microscópio confocal. Nas Figuras 1-2, diferentes ramos dentro de um mandril dendrite tem organização do citoesqueleto diferentes. A Figura 1 mostra uma região do mandril de uma classe IV DA neurônio no estádio 1 º estágio larval. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO e detectado com um anticorpo anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Tubulina é detectada através de anticorpos anti α-tubulina e fluorescent secundário (Alexa Fluor 488). Os ramos principais são positivos para tubulina, alguns ramos laterais finas são tubulina-negativos. Um filme é um conjunto de cortes seriados através de uma coloração semelhante de uma classe I DA neurônio. A Figura 2 mostra uma região do mandril de uma classe IV DA neurônio corados com anticorpos contra Futsch e CD8 no estádio 1 º estágio larval. Os ramos principais são Futsch-positivos, alguns ramos laterais finas são Futsch-negativos. Figura 3. Traquéias na parede do corpo larval mostram uma organização de microtúbulos complexo. Filmes 2 e 3 mostram cortes seriados de coloração através dos músculos da parede do corpo e da traquéia. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig1.jpg" /> Figura 1. Fig. 1 mostra uma região do mandril de uma classe IV DA neurônio no estádio 1 º estágio larval. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO e detectados utilizando anticorpos anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Tubulina é detectada através de anti-&amp;-túbulosn anticorpo fluorescente e secundário (Alexa 488). AC painéis seqüenciais confocal z-seções (0.5μm),&#39;c-C &quot;, manchando de anticorpos único a partir do painel Exemplo de ramos com C. (amarelo ponta de seta) ou sem (roxo seta) microtúbulos são realçados. Red arrowheads microtúbulos destaque no subjacentes células epiteliais. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3662/3662fig2.jpg" /> Figura 2. Fig. 2 mostra uma região similar do mandril de um neurônio da classe IV corados com anticorpos contra Futsch e CD8 no estádio 1 º estágio larval. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO e detectados utilizando anticorpos anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Futsch é detectada através de anticorpos anti-Futsch e secundário fluorescente (Alexa 488). Os ramos principais são Futsch-positivos, alguns ramos laterais finas são Futsch-negativos. Exemplo de ramos com (seta amarela) ou sem (roxo seta) Futsch são realçados. Figura 3. Traquéia coradas utilizando o protocolo anti-tubulina descrito acima. Esta larva é de terceiro instar e dissecados como descrito anteriormente 23,24. Movie 3 mostra alargada cortes seriados do campo marcado por um quadrado. Movie 1. Seções Serial rastreamento coloração tubulina em todo o arbor dendríticas de uma classe que eu neurônio. O mandril todo é marcada com mCD8:: KO (Magenta) e detectados utilizando anticorpos anti-CD8 e fluorescentes secundário (Cy3). Tubulina (Green) é detectado com um anticorpo anti-α-tubulina e fluorescentes secundário (Alexa Fluor 488). Escala: de um lado da imagem de vídeo corresponde a 46.88μm na seção. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie1.avi">Clique aqui para ver o filme.</a> Filme 2. Seções Serial rastreamento coloração tubulina em bodmúsculos y parede de uma larva de terceiro instar. Tubulina é detectada através de anti-α-tubulina anticorpo fluorescente e secundário (Alexa Fluor 488). Escala: de um lado da imagem de vídeo corresponde a 46.88μm na seção. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie2.avi">Clique aqui para ver o filme.</a> Movie 3. Seções Serial rastreamento coloração tubulina em um corpo de parede da traquéia de uma larva de terceiro instar, marcado com um quadrado no Figure.3. Tubulina é detectada através de anti-α-tubulina anticorpo fluorescente e secundário (Alexa Fluor 488). Escala: de um lado da imagem de vídeo corresponde a 46.88μm na seção. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3662/YalginMooreMovie3.avi">Clique aqui para ver o filme.</a>

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Não temos nada a revelar.

Para entender o quão complexo formas de células são alcançados, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método etiquetagem robusta imuno ensaio para a organização de microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica de neurônios sensoriais. Além da coloração neurônios sensoriais, este método obtém coloração imuno robusto de traquéia, músculos e tecidos outra parede do corpo. Nós usamos esse protocolo para exa...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Catálogo número </th><th> Comentários (Opcional) </th></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Dumont </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Microtesoura </td><td> FST </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> Do mouse anti-α-tubulina (Clone: ​​DM1A) </td><td> Sigma </td><td> T9026 </td><td> Diluição 1 / 1000 </td></tr><tr><td> Rato anti-Futsch (Clone: ​​22C10), sobrenadante </td><td> Desenvolvimento Estudos Hibridoma Banco </td><td> 22C10 </td><td> Diluição 1 / 1000 </td></tr><tr><td> Rat anti-CD8 (Clone: ​​5H10) </td><td> Caltag </td><td> MCD0800 </td><td> Diluição 1 / 1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A-11001 </td><td> Diluição 1 / 500 </td></tr><tr><td> Cy3 IgG anti-rato </td><td> Immunoresearch Jackson </td><td> 712-166-150 </td><td> Diluição 1 / 200 </td></tr></tbody></table>

immunohistological labeling of microtubules in sensory neuron dendrites, tracheae, and muscles in the drosophila larva body wall

Para entender como as diferenças de formas complexas de células são alcançados, é importante seguir precisamente organização de microtúbulos. A Drosophila parede do corpo larval contém vários tipos de células que são modelos para o estudo celular e morfogênese do tecido. Por exemplo traquéias são usados ​​para examinar morfogênese tubo 1, ea arborização dendrítica (DA) neurônios sensoriais da larva Drosophila tornaram-se um sistema primário para a elucidação da geral e neurônio-específico de classe mecanismos de diferenciação 05/02 dendríticas e degeneração 6 . A forma de ramos dendríticos podem variar significativamente entre as classes de neurônios, e até mesmo entre os diferentes ramos de um único neurônio 7,8. Estudos genéticos em neurônios DA sugerem que a organização do citoesqueleto diferencial pode subjacentes diferenças morfológicas na forma ramo dendríticas 4,9-11. Nós fornecemos um método de etiquetagem robusta imunológica a umssay in vivo organização de microtúbulos em DA neurônio sensorial dendrite arbor (Figuras 1, 2, Movie 1). Este protocolo ilustra a dissecção e imunomarcação de larva de primeiro ínstar, uma fase em conseqüência dendrito ativo neurônio sensorial e organização ramificação está ocorrendo 12,13. Além da coloração neurônios sensoriais, este método obtém etiquetagem robusta de organização de microtúbulos nos músculos (Filmes 2, 3), traquéia (Figura 3, Movie 3), e tecidos outra parede do corpo. É valioso para pesquisadores que desejam analisar a organização de microtúbulos in situ na parede do corpo quando se investiga os mecanismos que o tecido de controle e forma da célula.

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Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

Para compreender como as formas de células complexas, como dendritos neuronais, são alcançados durante o desenvolvimento, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método imuno etiquetagem robusta para analisar a organização dos microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica neurônio sensorial, traquéia, músculos e outros<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva tecidos parede do corpo.

Labeling imuno dos microtúbulos no Dendrites neurônio sensorial, traquéias, e Músculos no Drosophila Wall Corpo Larva

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval ...

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Neuroscience

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

12.3K visualizações.  RIKEN Brain Science Institute. Para compreender como as formas de células complexas, como dendritos neuronais, são alcançados durante o desenvolvimento, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método imuno etiquetagem robusta para analisar a organização dos microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica neurônio sensorial, traquéia, músculos e outros Drosophila Larva tecidos parede do corpo.