Financiamento para o Dr. Thornton da Pfizer Limited é reconhecido agradecimento.

1. Recolha, Armazenamento e Preparação de soro e fluidos de lavagem broncoalveolar <ol><li> Recolher o soro de amostras de sangue não tratados, permitindo que o sangue coagular a 4 ° C, e soro de armazenamento, conforme alíquotas a -20 ° C antes de usar. Fluidos lavado broncoalveolar (BAL) deve também ser armazenados como alíquotas a -20 ° C. Nota: Armazenamento de soro e LBA como alíquotas limita o potencial de degradação do antigénio alvo por repetidos de congelamento-descongelamento das amostras durante a repetição do teste. </li><li> As amostras descongelamento e misturar o amostras de soro e BAL completamente por vórtice e centrifugação durante 1 min a 14.000 rpm. </li><li> Para os testes de rotina de amostras de soro humano, diluir a 1:01 de soro (v / v) com meio de cultura de tecidos (TCM). TCM consiste em meio RPMI-1640, 10% (v / v) de soro de vitelo fetal, 1% (v / v) de solução de L-glutamina 200mM, e azida de sódio (0,02% w / v) como conservante. O meio é preparado antecipadamente e podem ser armazenadas a 4 ° C durante vários meses. Aplicar 100 uL da diluted soro para o LFD. </li><li> Para humanos fluidos BAL, e para fluidos BAL de modelos animais, aplicam-se 100 uL de amostra pura para o LFD, sem pré-tratamento. </li><li> Para soro a partir de modelos animais, diluir soro 1:2 (v / v) com tampão fosfato salino contendo 4% (w / v) de EDTA, o calor para 3min num banho de água a ferver, de centrifugação durante 5 min a 14.000 rpm, e aplicar 100 ul de sobrenadante limpo para o dispositivo de LFD. </li></ol> 2. Aplicação de Soro e BAL para o dispositivo de fluxo lateral- <ol><li> Armazenar os dispositivos de fluxo lateral, à temperatura ambiente (23 ° C). A esta temperatura, os dispositivos são estáveis ​​durante 12 meses. Remova os dispositivos de suas bolsas e coloque sobre uma superfície plana. </li><li> Usando uma ponta de pipeta estéril, aplicar 100 uL de pré-tratado amostra de soro ou puro BAL para a porta de libertação do dispositivo. </li><li> Permitir que o ensaio para executar durante 15 min à temperatura ambiente, momento em que os resultados dos testes devem ser registados. Nota: No segundo o fluido vai ser sien migrar por acção capilar ao longo da membrana de nitrocelulose na janela de observação. </li></ol> 3. Gravação e Interpretação dos Resultados LFD <ol><li> O LFD consiste de uma linha de controlo interno (indicado pela letra C na caixa de plástico) e uma linha de teste (indicado pela letra T). A linha de controlo deve aparecer sempre independentemente do antigénio Aspergillus na amostra de soro ou BAL. Isso mostra que o ensaio foi executado corretamente. </li><li> Se o antigénio Aspergillus está presente na amostra de soro ou BAL, a linha de teste também aparece dentro 15min de aplicação da amostra. Devido à intensidade da linha de teste é proporcional à quantidade de Aspergillus presente antigénio na amostra, a linha de teste pode aparecer como um positivo fraco (+), um positivo moderado (+ +) ou como uma forte positivo (+ + +) . No entanto, qualquer linha de teste positivo, independentemente da intensidade, que indicam a presença de Aspergillus antigénio na amostra. Em diaausência de antigénio e Aspergillus, nenhuma linha de teste irá aparecer, eo resultado é registado como negativo (-). </li></ol> 4. Os resultados representativos Os exemplos representativos de negativas, fracamente positivo, moderada positivos, e forte positivos LFD com amostras de BAL e soro são mostrados na Figura 1. Resultados de testes positivos de antígeno-LFD (fraca e forte) ou negativo testes LFD utilizando fluidos de BAL de leucemia mielóide aguda (LMA) dos pacientes diagnosticados de acordo com critérios da EORTC / MSG de diagnóstico são mostrados na Tabela 1. Incluem-se nesta tabela são os correspondentes clínicos e micológicos (galactomanano e cultura) de dados e resultados de um teste de PCR Aspergillus específico desenvolvido no Hospital St. Bartholomews 8, para cada paciente. O diagnóstico da doença foi baseada em fatores do hospedeiro (neutropenia, uso prolongado de corticosteróides, o tratamento com outros reconhecidos de células T immunosuppressants), os critérios clínicos e GM positividade para BAL (aqui definida como um índice GM&gt; 0,8 valor). Sob os 2002 EORTC / MSG 10 diretrizes, os pacientes 12, 13 e 16 foram diagnosticados com IA &quot;possível&quot; com base em fatores do hospedeiro e os critérios clínicos ou positividade GM. De acordo com a revista (2008) EORTC / MSG diretrizes 2, fatores do hospedeiro e positividade GM isoladamente ou fatores do hospedeiro e os critérios clínicos si só, não indicam &quot;possível&quot; infecção fúngica invasiva, a menos que acompanhado de prova a partir de dados clínicos e micológicos, respectivamente. Paciente 6 foi diagnosticada com IA &quot;provável&quot; em ambos os 2002 e 2008, porque as orientações de fatores do hospedeiro, maiores e menores características clínicas e positividade GM. Note, que, embora nem o LFD nem PCR estão incluídas nas diretrizes do EORTC / MSG, há um consenso forte entre os dois ensaios eo teste de galactomanano comercial indicando a presença de Aspergillus antígeno e ácido nucléico na amostra BAL<html> s de pacientes 6 e 12. Resultados adicionais de ensaios que demonstram a eficácia dos ensaios LFD e PCR no diagnóstico IPA podem ser encontrados em Johnson et al 8. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3721/3721fig1.jpg" /> Figura 1. Negativo (linha de controlo apenas) e positivo (de controlo e da linha de teste) os resultados dos testes LFD usando soro e BAL. As intensidades das reacções da linha de teste são proporcionais às concentrações do antigénio alvo nas amostras de soro e BAL. Reacções tipicamente variar de fraco (+) através moderada (+ +) a forte (+ + +). Independentemente da intensidade da linha de teste, todos os três séricos reacções positivas indicaria doença aspergilose invasiva pulmonar devido à presença de circulação de antigénio Aspergillus na corrente sanguínea. Positivos reacções BAL (fraco, moderado ou forte) indicaria a germinação de esporos e desenvolvimento de hifas potencialmente patogénicos nos pulmões. pdflinebreak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Nenhum paciente. </td><td> Patiinformações ent </td><td> Os critérios clínicos 1 </td><td> LBA cultura 2 </td><td> GM EIA índice 3 </td><td> EORTC / MSG (2002) 4 </td><td> EORTC / MSG (2008) 5 </td><td> Aspergillus resultado da PCR </td><td> Resultado LFD </td></tr><tr><td> 6 </td><td> - </td><td> Principais sinais de TC (nódulo e halo) e um menor </td><td> Negativo </td><td> 0,9 (positivo) </td><td> Provável </td><td> Provável </td><td> Positivo </td><td> Fracamente positivo (+) </td></tr><tr><td> 12 </td><td> Presume infecção fúngica anterior </td><td> Não maior, uma menor </td><td> Candida glabrata </td><td> 6,43 (positivo forte) </td><td> Possível </td><td> Nenhum </td><td> Positivo </td><td> Strong positivo (+ + +) </td></tr><tr><td> 13 </td><td> Staph coagulase-negativoylococcus e E. coli no sangue </td><td> Não maior, menor dois </td><td> Negativo </td><td> 0,25 (negativo) </td><td> Possível </td><td> Nenhum </td><td> Negativo </td><td> Negativo (-) </td></tr><tr><td> 16 </td><td> Infecção no peito </td><td> 3 critérios menores, incluindo derrame plural novo infiltrado mais </td><td> Negativo </td><td> 0,16 (negativo) </td><td> Possível </td><td> Nenhum </td><td> Negativo </td><td> Negativo (-) </td></tr></tbody></table> 1 Nódulos ou halos em uma tomografia computadorizada é sugestivo de infecção fúngica 2 Cândida glabrata no fluido BAL seria considerado como um contaminante como é o segundo de levedura mais comum isolado como parte de flora normal humanos 9 3 Um índice de&gt; 0,8 no teste de EIA GM do LBA é indicativo de infecção por Aspergillus 4 Com base nas 2002 EORTC / MSG critérios diagnósticos para &#39;pose &#39;,&#39; provável &#39;ou&#39; comprovada &#39;doença fúngica 10 5 Com base na revista (2008) EORTC / MSG critérios diagnósticos para &#39;possível&#39;, &#39;provável&#39; ou &#39;comprovada&#39; doença fúngica 2 Tabela 1. Resultados dos testes de LFD de amostras de LBA de pacientes com leucemia mielóide aguda com provável IPA e controle de pacientes com LMA (sem evidência de infecção), e EORTC / MSG diagnóstico de infecção.

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Não temos nada a divulgar.

A identificação definitiva do IPA só pode verdadeiramente ser alcançado pelo isolamento do agente etiológico a partir de amostras de biópsia, mas a recuperação de amostras adequadas muitas vezes não é possível em pacientes muito doentes e Aspergillus é raramente recuperável a partir de sangue. Enquanto grandes avanços foram feitos no uso de tomografia computadorizada de varredura do peito no diagnóstico IPA, características que são sugestivos do IPA pulmonar, como o &quot;halo&quot; ou &quot;ar crescentes&quot; sinais são ou transitória ou pode ser atribuído a artefatos respiratórios ou outras infecções fúngicas 11,12. Tais dados são, portanto, suplementado com técnicas serológicas que visam identificar moléculas de assinatura (GM e β-glucano) a partir de fungos que são em circulação no soro do paciente ou que estão presentes nos fluidos BAL, expectoração ou amostras de urina 13. Embora estes testes exibir sensibilidade satisfatória, falta-lhes a especificidade suficiente ou se sofre de interferência sob certas condições 1,6 </sup&gt;. O teste para a detecção LFD IPA aqui apresentado permite o diagnóstico o «ponto-de-cuidado &#39;de IPA e exploits tecnologia que tem sido utilizada até à data em testes para a detecção de vírus, bactérias, parasitas e toxinas 14-19 e, mais notoriamente, para a gravidez em casa testa introduzido pela primeira vez por Unipath em 1988. No LFD Aspergillus descrito aqui, o Aspergillus específico MAb JF5 é imobilizado a uma zona de captação (a linha de teste) em uma membrana de nitrocelulose poroso. Imunoglobulina anti-rato imobilizado para a membrana numa zona separada serviu como um controlo interno (linha de controlo). Por adição de soro ou fluido BAL para a porta de libertação, o MAb conjugado de ouro coloidal JF5-no bloco de libertação se liga ao antigénio alvo e do complexo, em seguida, passa ao longo da membrana porosa por acção capilar. MAb JF5 imobilizado na zona de captura liga-se ao JF5-coloidal complexo ouro-antigénio, resultando em uma linha de teste vermelho. Qualquer desacoplado ouro coloidal-JF5conjugado liga-se ao controlo interno, indicando que o ensaio foi executado correctamente. Isso resulta em uma linha de controle vermelho. O teste é rápido, tendo apenas 15 minutos para realizar, é barata em comparação com os testes de soro e BAL baseado em GM e β-glucano de detecção, e não requer equipamentos caros ou instalações laboratoriais extensas para ser executado. Além disso, o MAb JF5 não reagem de forma cruzada com as drogas ou contaminantes que foram mostrados para causar falso-positivo de reacção na GM e β-glucano testes 1,4,6. Uma vantagem adicional importante sobre os actuais testes de diagnóstico é a capacidade para detectar a actividade LFDs que é indicativo de crescimento invasivo de espécies de Aspergillus. Um passo essencial no processo de LFD é a necessidade de ler os resultados 15 minutos após a aplicação da amostra de soro ou LBA para o dispositivo. O teste não deve ser deixada para mais de 15 min antes de gravar os resultados, como este viés de resultado pode interpretatipor diante. A fraca reação não será reforçada mediante o alargamento do período de incubação. O tratamento térmico de soro a partir de modelos animais de infecção foi encontrada para melhorar a sensibilidade do ensaio. Uma limitação do teste é que ele é qualitativa, e conta com o operador para fazer uma avaliação subjetiva de positividade. A intensidade da linha de teste varia de acordo com o conteúdo de antigénios das amostras de soro e BAL (Figura 1). No entanto, qualquer reacção positiva (determinada por comparação com negativos conhecidos) indica a presença de Aspergillus antigénio e, por conseguinte, a infecção. Para limitar a subjetividade de ensaios LFD, dispositivos portáteis estão disponíveis, que possibilita a quantificação das intensidades de linhas LFD teste e permitir o estabelecimento de limiares para a detecção de antígenos 20. Desenvolvimentos futuros do LFD incluem a sua comercialização e no desenvolvimento de um LFD multiplex, que permite a detecção simultânea de outros agentes patogénicos fúngicos invasivasutilizando os AcM altamente específicos 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Aspergillus LFD </td><td> Universidade de Exeter </td><td></td><td> Disponível a partir do autor correspondente, mediante pedido </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Sigma </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de vitelo </td><td> Biosera </td><td> S9100 </td><td> Outras fontes de soro de vitela fetal pode ser usado na preparação de TCM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BPE120-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of invasive pulmonary aspergillosis in haematological malignancy patients by using lateral-flow technology

A aspergilose pulmonar invasiva (IPA) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes com doença hematológica maligna e tronco hematopoéticas receptores de transplantes de células 1. Detecção de IPA representa um desafio formidável de diagnóstico e, na ausência de um &#39;padrão de ouro&#39;, depende de uma combinação de dados clínicos e de microbiologia e histopatologia sempre que possível. Diagnóstico do IPA devem estar de acordo com a Organização Européia para Pesquisa e Tratamento do Câncer e do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas Grupo de Estudos de Micologia consenso (EORTC / MSG) definir &quot;comprovada&quot;, &quot;provável&quot;, e &quot;possível&quot; doenças invasivas por fungos 2 . Actualmente, não à base de ácido nucleico testes foram externamente validado para a detecção de IPA e para que a reacção em cadeia da polimerase (PCR) não está incluído nos actuais critérios da EORTC / MSG de diagnóstico. Identificação de Aspergillus em cortes histológicos é problemática devido à semedades nas morfologias das hifas com outras invasoras fungos 3, e identificação comprovada exige o isolamento do agente etiológico em cultura pura. Cultura abordagens dependem da disponibilidade de amostras de biópsia, mas estes nem sempre são acessíveis em pacientes doentes, e nem sempre produzir propágulos viáveis ​​para a cultura quando obtido. Uma característica importante na patogênese de Aspergillus é angio-invasão, uma característica que proporciona oportunidades para controlar o fungo imunologicamente por meio de testes que detectam assinaturas moléculas antigénicas características no soro e lavado broncoalveolar (LBA) líquidos. Isto conduziu ao desenvolvimento do ensaio imunoenzimático Platelia (GM-EIA) que detecta Aspergillus galactomanano e um &#39;pan-fúngica&#39; ensaio (ensaio Fungitell) que detecta o componente da parede celular conservada fúngica (1 → 3)-β-D- glucano, mas não nas Mucorales que não possuem este componente em suas paredes celulares 1,4. Éprocessa em torno da precisão destes testes 1,4-6 levou ao desenvolvimento recente da próxima geração de anticorpo monoclonal (MAb)-ensaios baseados que detectam marcadores substitutos da infecção 1,5. Thornton 5 recentemente descrita a geração de um MAb Aspergillus-específico (JF5) usando hibridoma tecnologia ea sua utilização para desenvolver um imuno-cromatografia dispositivo de fluxo lateral (LFD) para o ponto-de-cuidado (POC) diagnóstico de IPA. Uma grande vantagem do LFD é a sua capacidade para detectar a actividade desde MAb JF5 se liga a um antigénio glicoproteina extracelular que é secretado durante o crescimento do fungo activo apenas 5. Esta é uma consideração importante quando se utiliza fluidos tais como BAL pulmão para o diagnóstico de IPA desde esporos de Aspergillus são um componente comum de ar inalado. A utilidade do dispositivo para o diagnóstico de IPA foi demonstrada utilizando um modelo animal de infecção, em que o LFD exibido sensibilidade melhorada e specificity em comparação com o GM Platelia e Fungitell (1 → 3)-glucano β-D-ensaios 7. Aqui, apresentamos um procedimento simples LFD para detectar o antígeno Aspergillus em humanos soro e fluidos BAL. Sua velocidade e precisão fornece um romance adjunto teste point-of-care para diagnóstico do IPA em pacientes com doença hematológica maligna.

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Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

A rápida e precisa de teste ponto-of-care para a aspergilose pulmonar invasiva é apresentado. Leva vantagem de fluxo lateral-tecnologia, utilizando um anticorpo monoclonal específico que se liga a um<em&gt; Aspergillus</emAntígeno&gt; secretado durante infecções pulmonares. O ensaio é compatível com soro e lavado brochoalveolar e representa um teste adjuvante novo para o diagnóstico da doença.

Detecção de aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com doença hematológica maligna usando fluxo lateral Tecnologia

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

27.8K visualizações.  University of Exeter. A rápida e precisa de teste ponto-of-care para a aspergilose pulmonar invasiva é apresentado. Leva vantagem de fluxo lateral-tecnologia, utilizando um anticorpo monoclonal específico que se liga a um Aspergillus secretado durante infecções pulmonares. O ensaio é compatível com soro e lavado brochoalveolar e representa um teste adjuvante novo para o diagnóstico da doença.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

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Imunologia e Infecção

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

Tecnologia IgY: Extração de anticorpos de gema de ovo de galinha por polietileno glicol (PEG) Precipitação

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems Detecção (IVIS) de um vírus de Neuro-invasiva encefalítico

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

Detecção de Leucócitos Humanos Antigen Biomarkers no cancro da mama Utilizando tecnologia de biossensores livre-Label

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

Histológica quantificação para determinar o pulmão carga fúngica em aspergilose Experimental

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um Imprinting Molecular baseado Biosensor capacitivo

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...