Este trabalho foi suportado por uma concessão do NHLBI a RW.

1. Instalação e Operação Power Tower <ol><li> A torre de energia é colocado sobre uma peça rectangular de contraplacado que é fixada a uma tabela. A 4,5 engrenagem rpm do motor de Grainger repousa em cima de quatro 2 &quot;x6&quot; tábuas e uma placa de madeira compensada de ¾ de polegada. O motor, um controle de velocidade AC / DC, um fusível e uma chave liga / desliga estão ligados entre si em uma caixa de junção. </li><li> Para resfriar o motor, um buraco de 3 polegadas de diâmetro é cortado em uma peça vertical ½ polegada de madeira compensada. Por um lado, um ventilador de 3 polegadas está ligado ao contraplacado, e por outro lado, um de 3 polegadas de diâmetro do cilindro de metal está ligado. </li><li> Um braço feito por medida com um rolo rotativo montado na extremidade está ligada ao motor. O motor eo braço ligado girar no sentido horário, empurrando de um lado de um estoque de tubo dobrado ¾ polegada quadrada que está ligado à madeira compensada com uma dobradiça de porta. Uma roda está ligado ao lado de topo do material do tubo abaixo da plataforma para permitir que ele rolo contra a plataforma que é dirrectamente acima dela. </li><li> O braço empurra para baixo sobre uma extremidade do tubo de estoque e levanta a extremidade oposta, levantando uma plataforma de dois níveis (Figura 1D). Quando o rolo sobre o braço limpa o estoque tubo que permite o retorno do braço para a posição de partida, soltando a plataforma de volta para baixo (Figura 1F). </li><li> As plataformas consistem em racks que são colocados no topo de madeira compensada e fixado por cabos elásticos que são enganchadas olhos de parafuso. As plataformas de deslizar para cima e para baixo ao longo sliders gaveta que estão ligados à madeira compensada com colchetes. </li><li> Os frascos são colocados nas prateleiras e protegido por uma tela grade quadrada que é realizada no local com cordas elásticas. </li><li> Uma almofada de isopor é colocado embaixo da plataforma para amortecer o choque da queda. </li><li> A potência do motor é ajustada de tal modo que um período total de rotação é de 15 segundos de duração. </li></ol> 2. Protocolo de exercício <ol><li> As moscas são alojados em um 25 ° C incubadora com 50% de humidade e uma luz de 12 horas / daciclo rk. Tanto o treinamento físico e avaliação da capacidade de exercício são realizadas em uma sala de 25 ° C com temperatura controlada. </li><li> As moscas são recolhidos e idade combinados dentro de 1-2 dias de cada outro. Um mínimo de 240 moscas é necessária para o acompanhamento longitudinal de geotaxis resistência e negativos (subida) de habilidade, dois indicadores fisiológicos que refletem os efeitos do treinamento físico. Acompanhamento longitudinal permite o isolamento de mudança induzida em relação aos valores iniciais para cada coorte, sem efeitos de confusão de variação entre as coortes. Moscas para experimentos adicionais devem ser recolhidos, conforme necessário. </li><li> Após a recolha, as moscas são divididos em 120 moscas experimentais, os quais serão submetidos ao regime de exercício, e 120 moscas de controlo, que não vai ser exercida. As moscas são armazenadas em frascos de 20 moscas cada. Os frascos de moscas experimentais estão conectados com Flugs empresa de acetato de celulose e os frascos de controle (unexercised) moscas estão conectados com spo maciorolhas ESL, os quais podem ser empurradas para baixo para imobilizar as moscas, enquanto na torre de energia. Esponja é usado para a imobilização, porque o seu tamanho adaptativa permite uma fácil colocação perto do fundo do frasco. O material mais macio esponja também reduz os danos causados ​​pelas Flugs mais sólidos. </li><li> Moscas sobre a torre de energia são armazenadas e exercido em frascos que contêm 5 mL do alimento, que lhes proporciona um suave pouso de moscas que são exercidas em frascos vazios. O alimento é tipicamente composto por sacarose a 10%, 10% de levedura, e agar a 2% em água, embora não se observa moscas para comer, muitas vezes durante o curso de uma sessão de treino. Se frascos vazios são utilizados durante a formação, a percentagem de moscas que sofrem de lesões é dramaticamente aumentada. </li><li> A torre de energia é operado numa sala com temperatura controlada que é mantida a 25 ° C. Moscas experimentais são colocados sobre a torre de energia e fez subir. Moscas de controle também são colocados na torre de energia, mas a rolha de esponja é pushed para baixo para dentro do frasco de aproximadamente 3 mm acima das moscas, a fim de limitar o movimento. Este grupo serve como um controle para todos os efeitos da torre de energia que não estão relacionados ao exercício. Apesar de algum espaço ainda existe para estas moscas de manobra, temos observado repetidamente que as moscas sob estas condições executar muito pouco e não demonstram uma resposta fisiológica ao exercício. Pode também ser desejável incluir um grupo de controlo adicional que não é colocada sobre a torre de energia de todo. </li><li> As moscas são exercidos cinco dias consecutivos cada semana, utilizando uma programação em rampa (Figura 2). Durante uma semana as moscas são exercidas por 2 horas por sessão por semana, dois para 2,5 horas por sessão, e três semanas para 3 horas por sessão. Embora outros regimes foram testados, este protocolo produz resultados consistentes em genótipos e sob condições diferentes. Este protocolo é, no entanto, sujeitas a uma ampla gama de variações possíveis que possam atender uma experiência particular. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Exercício e Fadiga Locomotor <ol><li> Hora de fadiga durante o exercício de resistência é um indicador útil fisiológico para confirmar e / ou quantificar a capacidade de exercício de uma determinada coorte. Os ensaios de fadiga pode ser realizada longitudinalmente sobre coortes que serão utilizados em experiências de formação. Ensaios podem ser realizados, quer antes da formação, após a conclusão do protocolo de formação, ou ambos. Outros momentos intermediários podem ser adicionados se traçar o progresso incremental durante o treinamento é desejada. O ensaio de fadiga pode também ser usado para medir a resistência do exercício como uma resposta a outros tratamentos do que o protocolo de formação, tais como alteração dieta (Figura 3B). </li><li> Ensaios de fadiga deve ser conduzida em um dia quando o treinamento não está ocorrendo. Tanto o moscas experimentais e de controlo são colocados sobre a torre de energia em frascos de 20 cada um e feito subir até desgastado. A fadiga é reconhecida como a falta de resposta a um estímulo negativo com a escalada geotaxis sercomportamento. Comportamento à fadiga é pontuada pela observação visual. </li><li> Um frasco de moscas é considerado &quot;cansado&quot; quando 5 ou menos moscas são capazes de subir mais de 2 centímetros por quatro quedas consecutivas. Frascos fadiga são removidos da torre de energia ao mesmo tempo que ainda está em funcionamento, eo tempo de remoção é gravado. Tempos de remoção podem ser representados como um histograma aninhada, ou como um &quot;tempo até a falha&quot; enredo. Um exemplo dos dados plotados como um &quot;tempo até a falha&quot; trama é mostrada na Figura 3B. </li><li> Os frascos são monitorizados a intervalos de 10 minutos para um máximo de 10 horas (Figura 3B). </li></ol> 4. Da capacidade de exercício, à Idade e Locomotor <ol><li> Uma vez que este protocolo de treinamento se baseia no comportamento executando induzido, um ensaio preliminar para quantificar efeitos do treinamento é longitudinalmente medir a mudança na velocidade média de corrida durante o treino. Durante o curso de formação, 120-mosca coortes de moscas exercitados e unexercised são testados diariamente para a sua resposta a um negativo geotaxis stimulus. A técnica descrita no ANEL Gargano et al. (2005) é usado para medir a capacidade das moscas escalar 12. Resumidamente, esta técnica mede a altura média escalada por um frasco de moscas durante um tempo definido após a indução da geotaxis negativos. A altura subiu durante um tempo definido é equivalente a escalada de velocidade. As medições são realizadas antes de colocar na máquina de moscas para a formação diária, de modo a evitar as complicações de fadiga após longo do dia. </li><li> No nosso protocolo padrão, as moscas são exercidas por um total de três semanas e capacidade de escalada é examinada para um total de cinco semanas: três semanas durante o exercício de formação e de duas semanas após a cessação do exercício (Figura 2). Isto permite que o experimentador para traçar se os efeitos de exercício sobre a mobilidade persistir após a cessação do programa. </li><li> Quatro fotografias de desempenho de cada coorte ANEL diariamente são usados ​​para a análise da capacidade de escalada. Seis frascos são incluídos em cada fotografia. G Negativoeotaxis é induzida, e usando uma câmara temporizado, uma fotografia é tirada após um número definido de segundos. Nós normalmente usam dois segundos, embora este possa ser variado dependendo das condições experimentais. Para cada fotografia, cada frasco é dividido em quatro quadrantes de igual altura, e software de processamento de imagem é usada para atribuir a cada mosca uma pontuação baseada no quadrante chegou dentro do prazo estipulado. Moscas que sobem para o quadrante superior recebem uma pontuação de 4, voa no quadrante mais elevado seguinte recebe a 3, voa no quadrante segundo maior receberá a 2, e as moscas no menor quadrante receber um 1. As moscas que não escalar fora do fundo em todos recebem uma pontuação de 0. </li><li> Para cada frasco em uma dada fotografia, um &quot;índice de escalada&quot; é gerado pela média das pontuações de todas as moscas nesse frasco. Índices de cada frasco a partir dos quatro fotografias se então a média para dar um índice de escalada final para esse dia. </li><li> Todos os experimentos são conduzidos geotaxis negativos longitudinaldinally. Os resultados são normalizados para a inicial &quot;pré-exercício&quot; pontuação a fim de reduzir o efeito da variação na capacidade de escalada coorte e realçar a mudança relativa longitudinal da capacidade de escalada de uma coorte como o resultado da formação de exercício. A pontuação inicial é determinada pela média dos índices os três primeiros dias de escalada e é atribuído um valor de 1. Ensaios subsequentes são então expressos como uma percentagem do índice inicial. </li></ol> 5. Os resultados representativos Tipo selvagem moscas responder a um protocolo de resistência com uma diminuição relacionada com a idade reduzida em capacidade de escalada, que persiste após o fim do treinamento, como refletido nos ensaios ANEL longitudinal ao longo de cinco semanas de idade (Figura 3A). Esta descida retardada em geotaxis negativos é um padrão de resposta fenotípica que pode servir como um controlo positivo para assegurar que a resposta de tipo selvagem exercício está ocorrendo normalmente. Este conjunto de dados é apresentado como um exemplo de como oindução de exercício pelo programa torre de energia pode ser utilizada como uma entrada comportamental. A capacidade de vários factores genéticos ou ambientais que modulam este efeito pode então ser avaliado. Inversamente, a torre de energia pode também ser usado como uma saída em vários modelos experimentais. Por exemplo, a dieta do genótipo, ou outras condições pode ser variada. Em seguida, o efeito destas variações na fisiologia do exercício pode ser testado usando o torre de energia. Aqui, vamos mostrar um exemplo desta abordagem. Quando as moscas com uma percentagem variando de sacarose nas suas dietas foram testadas para o tempo para a fadiga teor de sacarose, aumento correlacionada com a capacidade de resistência aumentada (Figura 3B). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig1.jpg" /> Figura 1. Operação da torre de energia. (AC) O braço curvado motorizado com rolo acoplado gira no sentido horário, até que entra em contacto com o tubo dobrado quadrado. (D, E) Abraço empurra para baixo sobre o tubo dobrado quadrado, fazendo com que a plataforma que é carregado com frascos de moscas para levantar. (F) À medida que o braço limpa o tubo a plataforma é deixado cair de volta para baixo, forçando as moscas para retornar para o fundo do frasco. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig2.jpg" /> Figura 2. Sugerida protocolo de exercício. Voa submetido ao protocolo de formação são feitas para exercer durante cinco dias por semana sob um regime de três semanas longo rampa que aumenta progressivamente a duração do exercício das inicial de 2 horas por 30 minutos em cada semana. Análises padrão incluem ensaios de fadiga antes e após o programa de exercícios e ensaios de ANEL de semana de 1 a 5 semanas. Todos os ensaios são realizados em duplicado em um número igual de moscas não exercidas como um controlo negativo. Outros vários testes fisiológicos ou bioquímica pode ser conduzida como determinado pelo investigador. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3786/3786fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Exercícios de resistência altera vários aspectos da mobilidade. (A) DE ANEL ensaios realizados longitudinalmente em idades em um único par de anos Masculino 1 W 67C23 coortes. Pareados por idade, geneticamente idênticos exercido e moscas de controle não exercidas foram medidos diariamente para a velocidade escalar média. Os resultados são expressos em termos de um índice de escalada que é normalizado para a altura média subir através dos primeiros três dias de medição. Exercício treinados moscas exibido um declínio age-related diminuição na capacidade geotaxis negativo em comparação com pareados por idade irmãos exercitada em toda as idades (2-way ANOVA, p &lt;0,005). (B) os ensaios de fadiga realizados por 8 horas sobre a idade-pareado moscas fêmeas Canton S mostram um efeito significativo do teor de sacarose na dieta sobre o tempo de fadiga (Log-rank, p &lt;0,0001). Antes da experiência, as moscas foram alimentados com uma dieta de levedura sacarose / / ágar, com 10% do peso / volume simconcentração r, e uma percentagem variando de sacarose dietética. Cinco frascos de 20 moscas cada foram testados para cada dieta. Gráfico mostra quantos frascos ainda tem cinco ou mais moscas rodando em um ponto determinado momento. Estes resultados podem ser tratados estatisticamente e graficamente como uma sobrevivência (ou tempo até a falha) curva, com o &quot;fracasso&quot; de um frasco a ser definido como um momento em que menos de cinco moscas continuam a responder a estímulos geotaxis negativo. Note-se que muitos outros desenhos de estudo possíveis e tratamentos estatísticos são possíveis, e tratamento de dados e de medição devem ser adaptados para atender objetivos individuais.

<ol>
	<li>Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Prevalence+of+Diabetes:+Estimates+for+the+year+2000+and+projections+for+2030.">Global Prevalence of Diabetes: Estimates for the year 2000 and projections for 2030.</a> Diabetes Care. 25, 1047-1053 (2004).</li><li>Flegal, K. M., Carroll, M. D., Ogden, L. C., Johnson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+Trends+in+Obesity+Among+US+Adults.">Prevalence and Trends in Obesity Among US Adults.</a> JAMA. 288, 1723-1727 (1999).</li><li>Hubert, H. B., Feinleib, M., McNamar, P. M., Castelli, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+an+Independent+Risk+Factor+for+Cardiovascular+Disease:+A+26-year+Follow-up+of+Participants+in+the+Framingham+Heart+Study.">Obesity as an Independent Risk Factor for Cardiovascular Disease: A 26-year Follow-up of Participants in the Framingham Heart Study.</a> Circulation. 67, 698-977 (1983).</li><li>Ross, R., Dagnone, D., Jones, P. J. H., Smith, H., Paddags, A., Hudson, R., Janssen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+in+obesity+and+related+comorbid+conditions+after+diet-induced+weight+loss+or+exercise-induced+weight+loss+in+med+â&#x20AC;&#x201C;+A+randomized,+controlled+trial.">Reduction in obesity and related comorbid conditions after diet-induced weight loss or exercise-induced weight loss in med â&#x20AC;&#x201C; A randomized, controlled trial.</a> Annals of Internal Medicine. 133, 92-103 (2000).</li><li>Goodyea, L. J., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+Glucose+Transport,+and+Insulin+Sensitivity.">Exercise Glucose Transport, and Insulin Sensitivity.</a> Annual Review of Medicine. 49, 235-261 (1998).</li><li>Linke, A., Adams, V., Schulze, P. D., Erbs, S., Gielen, S., Fiehn, E., Mobius-Winkler, S., Schubert, A., Schuler, G., Hambrecht, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidative+Effects+of+Exercise+Training+in+Patients+With+Chronic+Heart+Failure.">Antioxidative Effects of Exercise Training in Patients With Chronic Heart Failure.</a> Circulation. 111, 1763-1763 (2005).</li><li>Kemi, O. J., Ellingsen, O., Smith, G. L., Wisloff, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+changes+in+calcium+handling+in+left+ventricular+cardiomyocytes.">Exercise-induced changes in calcium handling in left ventricular cardiomyocytes.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 356-368 (2008).</li><li>Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+muscle+mitochondrial+enzyme+activity+and+oxidative+capacity+in+man:+alterations+with+disease.">Relationships between muscle mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 80, 22-27 (1999).</li><li>Wu, Z., Puigserver, P., Andersson, U., Zhang, C., Adelmant, G., Mootha, V., Troy, A., Cinti, S., Lowell, B., Scarpulla, R. C., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+Controlling+Mitochondrial+Biogenesis+and+Respiration+through+the+Thermogenic+Coactivator+PGC-1.">Mechanisms Controlling Mitochondrial Biogenesis and Respiration through the Thermogenic Coactivator PGC-1.</a> Cell. 98, 115-124 (1999).</li><li>Goto, M., Terada, S., Kato, M., Katoh, M., Yokozeki, T., Tabata, I., Shimokawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+Cloning+and+mRNA+Analysis+of+PGC-1+in+Epirtrochlearis+Muscle+in+Swimming-Exercised+Rats.">cDNA Cloning and mRNA Analysis of PGC-1 in Epirtrochlearis Muscle in Swimming-Exercised Rats.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , 274-350 (2000).</li><li>Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-Training+in+Young+Drosophila+melanogaster+Reduces+Age-Related+Decline+in+Mobility+and+Cardiac+Performance.">Exercise-Training in Young Drosophila melanogaster Reduces Age-Related Decline in Mobility and Cardiac Performance.</a> PLoS ONE. 4, e5886-e5886 (2009).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li></ol>

Não tenho nada para revelar.

O protocolo geral aqui apresentado tem sido bem sucedida em documentar efeitos fisiológicos após o treinamento. No entanto, diversas áreas deste protocolo estão sujeitos a modificações para se adequar às necessidades particulares experimentais. Por exemplo, o comprimento de formação eo número de ataques poderia potencialmente ser variado para tornar o programa mais ou menos exigente, como desejado. A altura do recipiente no qual a capacidade geotaxis negativo é medido pode ser alterado para aumentar a área disponível para a melhoria a ser documentada. Vários métodos de automatizar a quantificação da escalada de velocidade pode também ser aplicável. Em princípio, qualquer programa de software capaz de distinguir uma mosca de fundo pode ser usado para acelerar o processo de coleta de dados. Alguns aspectos do protocolo deve ser modificado apenas com muita cautela, no entanto. Por exemplo, experiências preliminares indicam fortemente que pelo menos um dia de descanso por semana tende a facilitar uma maior improvement de exercício diário incansável. Além disso, os ritmos circadianos ea temperatura são conhecidos por afetar o movimento de animais de sangue frio. O tempo do dia em que ocorre a formação pode ser variado, mas deve sempre ser consistente dentro de determinados grupos sob comparação, a fim de evitar a possibilidade de efeitos de confusão dos ritmos circadianos. O controle da temperatura também é essencial, e recomendamos uma sala dedicada a uma temperatura constante para a casa de equipamentos de exercício. Finalmente, os machos e fêmeas devem ser criados e medidos separadamente, a fim de evitar o potencial de efeitos de confusão de fertilidade e sexo diferenças na capacidade de exercício. As aplicações potenciais desta metodologia são limitadas apenas pela imaginação do pesquisador. Em trabalho preliminar, que têm utilizado esta metodologia em três amplas aplicações: <ol><li> Para medir o efeito do exercício de endurance sobre vários aspectos da biologia de tipo selvagem de toda as idades. </li><li> Tó medir o efeito do exercício de endurance sobre específicas fenótipos mutantes. </li><li> Para filtrar por fatores genéticos, que são necessárias para executar os benefícios do exercício </li></ol> Cada uma destas aplicações abrange uma grande variedade de possibilidades específicas. Com base em nossa experiência preliminar, fenótipos mutantes tendem a variar com o nível de exercício, tanto como eles variam com a dieta. O uso de modelos invertebrados para entender melhor a relação entre dieta, exercício e fisiologia do envelhecimento é talvez a mais importante aplicação geral do presente protocolo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Dayton Motoredutor </td><td> Grainger </td><td> 1LRA6A </td><td></td></tr><tr><td> Raco caixa elétrica </td><td> Grainger </td><td> 5A052 </td><td></td></tr><tr><td> Raco Capa </td><td> Grainger </td><td> 5A053 </td><td></td></tr><tr><td> Cooper Bussmann Fuse </td><td> Grainger </td><td> 6F043 </td><td></td></tr><tr><td> Cooper Bussmann Suporte de Fusível </td><td> Grainger </td><td> 1DD33 </td><td></td></tr><tr><td> Carling Technologies Mudar </td><td> Grainger </td><td> 2X464 </td><td></td></tr><tr><td> Dayton controle, velocidade AC / DC </td><td> Grainger </td><td> 4X796 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Flugs para estreitos tubos plásticos </td><td> Genesee Científico </td><td> 49-102 </td><td></td></tr></tbody></table>

endurance training protocol and longitudinal performance assays for drosophila melanogaster

Um dos problemas mais prementes das modernas pesquisas médicas são os níveis de afluência de obesidade, com o conseqüente aumento nas doenças associadas, como diabetes e doenças cardiovasculares 1-3. Um tópico importante de investigação sobre esses problemas de saúde associados envolve o papel do exercício de endurance como uma intervenção benéfica. O exercício físico é um barato, a intervenção não-invasiva com vários resultados benéficos, incluindo redução no excesso de gordura corporal 4, aumento da sensibilidade à insulina em músculo esquelético 5, aumentou respostas anti-inflamatórias e antioxidantes 6 e capacidade contrátil melhor em cardiomiócitos 7. Exercício de baixa intensidade é conhecido por aumentar a actividade mitocondrial e biogénese em humanos e ratinhos 8, com a coativador transcricional PGC1-α como um intermediário importante 9,10. Despite a importância do exercício como um instrumento para combater a vários importantes doenças relacionadas à idade, extensivos estudos longitudinais genéticas têm sido dificultado pela falta de um protocolo de treinamento de resistência por algumas espécies de vida curta modelo genético. A variedade de ferramentas genéticas disponíveis para uso com Drosophila, juntamente com a sua manutenção e vida útil curta barata, torná-lo um modelo atraente para um estudo mais aprofundado destes mecanismos genéticos. Com isto em mente, desenvolvemos um novo aparelho, conhecido como a torre de energia, em larga escala exercício de treinamento em Drosophila melanogaster 11. A torre de energia utiliza o comportamento das moscas geotaxis instintivo negativo para induzir repetidamente escalada rápida. Cada vez que os elevadores da máquina, em seguida, cai, a plataforma de moscas, as moscas são induzidos a subir. Moscas continuar a responder, enquanto a máquina está em funcionamento ou até que se tornem demasiado fatigado para responder. Assim, o pesquisador pode utilizar essa máquina para fornecer streinamento imultaneous a um grande número de moscas pareados por idade e geneticamente idênticas. Além disso, descrevemos ensaios associados úteis para acompanhar o progresso longitudinal das coortes mosca durante o treinamento.

Watch this Scientific Journal Video about Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster at JoVE.com

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

Nós descrevemos o protocolo primeiro treinamento de resistência para um importante modelo genético de espécies,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, E delinear ensaios de vários traçar melhorias no treinamento seguinte mobilidade.

Protocolo de treinamento de resistência e Ensaios de desempenho longitudinal para Drosophila melanogaster

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders ...

endurance-training-protocol-longitudinal-performance-assays-for

Research

JoVE Journal

Biology

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

15.5K visualizações.  University of Michigan Medical School. Nós descrevemos o protocolo primeiro treinamento de resistência para um importante modelo genético de espécies, Drosophila melanogaster, E delinear ensaios de vários traçar melhorias no treinamento seguinte mobilidade.

Vídeo: Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

De alta resolução de vídeo de Rastreamento Locomotion em Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Biologia

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Ensaios Neurocircuit para Apreensões em mutantes de Epilepsia Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Função de monitorização cardíaca em larval Drosophila melanogaster Para estudos fisiológicos

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medição do Tempo de vida em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Manutenção de um<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Gaiola População

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.