Este trabalho foi suportado pelo financiamento do Medical Ellison Foundation (SDP, <a href="http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp" target="_blank">http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp</a> ), NIH K01AG031917 (NJL, <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) e NIH R01AG030593 (SDP). Este trabalho utilizou os recursos do Envelhecimento Drosophila Core (DAC) do Centro de Choque Nathan de Excelência em biologia do envelhecimento financiado pelo Instituto Nacional do Envelhecimento P30-AG-013283 ( <a href="http://www.nih.gov" target="_blank">http://www.nih.gov/</a> ). Os autores gostariam de agradecer ao Laboratório Pletcher para discussões úteis e particularmente Brian Chung para a leitura crítica do manuscrito. Nós gostaríamos de agradecer Nick Asher e Kathryn Borowicz para a assistência com a coleta de dados.

Recomendamos armazenar alimentos experimentais, pasta de levedura e placas de agar de uva que aparecem no protocolo, a 4 ° C e utilizando-os dentro de 1-2 meses, desde que o molde e secura não tiver definido dentro das condições ambientais padrão, tanto para o larvar e adulto estágio envolve a manutenção de moscas em uma incubadora a 25 ° C com um ciclo de 12:12 horas de luz escura e 60% de humidade relativa. 1. Preparação de Alimentos Experimental <ol><li> Para o crescimento larval, usamos uma versão modificada Caltech Médio 5, que é abreviado neste protocolo como CT. </li><li> Recomenda-se uma dieta de adultos de Drosophila (SY) que consiste em açúcar (sacarose) e levedura (levedura de cerveja inteiro liofilizado) em uma base de agar a 2%, que foi fervida, suplementado com antibióticos e agentes anti-fúngicos, e distribuído (10 ml por frasco) 6. Alimento deve ser deixado solidificar e evaporar durante 12-24 horas antes do armazenamento. Uma vez que o ambiente nutriente pode substancialmente longevidade impacto, consistência nos processos de cozimento é fundamental, tanto dentro de um experimento e para a comparação entre os experimentos. </li><li> Se um agente farmacológico é para ser adicionado ao alimento para adultos, esta droga pode ser misturado em um pequeno lote de alimentos e em camadas (2 ml) na superfície da comida, com os frascos de controlo que receberam camadas contendo apenas veículo. </li></ol> 2. Preparação de uma pasta de levedura viva Combine 5-6 ml de água com 3 g de levedura seca activa e misturar bem. A consistência da pasta de levedura deve ser a de uma manteiga de amendoim lisa. 3. Preparação de uma placa de agar de uva <ol><li> Adicionar um pacote de uma pré-mistura de agar de uva em 500 mL de água destilada num balão de 1000 ml e seguir as instruções da embalagem para dissolver a mistura de agar de uva. </li><li> Verter cuidadosamente uma espessa camada de a mistura em placas de 100 mm de Petri, evitando a formação de bolhas. Um pacote de pré-mistura produz cerca de 14 graágar placas PE. </li><li> Deixar os meios arrefecer e solidificar a temperatura ambiente, com tampas de 15 min. As placas podem ser mantidas a 4 ° C, envolvido em película de plástico, ou utilizado imediatamente. </li></ol> 4. Coleta de ovos sincronizados Todos os meios utilizados no presente protocolo, isto é, de levedura, de placas de ágar de uva, CT e 10% de alimento SY, deve estar à temperatura ambiente. <ol><li> Espalhe uma camada de 2-3 cm de diâmetro de levedura cole em uma placa de ágar de uva e reserve. </li><li> Coloque uma gaiola grande coleção de ovos em uma almofada de CO 2 com a malha lateral-down para anestesiar as moscas. À base de nitrogênio anestesia é uma alternativa para o CO 2, usada por alguns laboratórios, que pode produzir resultados de alta qualidade 7. </li><li> Utilizando um funil, transferir 150-200 pares de moscas dentro da jaula recolha de ovos. </li><li> Colocar a placa de agar de uva para cobrir a extremidade aberta da gaiola, e fixá-lo com uma tampa de extremidade. </li><li> Coloque a gaiola do seu lado até moscas acordar.Em seguida, manter a gaiola, com o lado da placa de agar de uvas para baixo, na incubadora durante a noite. </li><li> No dia seguinte, a placa de troca de uva com um prato de uva recém-fermentado. Colocar somente cerca de 1 cm de diâmetro de massa de levedura sobre a superfície da placa. Descarte o 1 º placa de uva dia. </li><li> Permitir que os embriões de recolher na superfície da placa de agar de uva para 16-22 hr. Uma vez feito, recolher a placa de ágar de uva e descartar as moscas pai. </li><li> Lava-se a superfície das placas de agar de uva com 1x Tampão fosfato salino (PBS). Os ovos podem ser mobilizados por gentilmente raspando com um cotonete. Tomar cuidado para não danificar o início, ou raspar finos pedaços de agar para fora da superfície da placa. Com o auxílio de um funil, despeje os ovos lavados para um tubo cónico de 15 ml. </li><li> Deixe os ovos se depositam no fundo do tubo e decantar o sobrenadante, tendo o cuidado de não perder qualquer ovos. O volume restante deve ser em torno de 2-3 ml. </li><li> Adicionar 8-10 ml de PBS ao tubo e repetir o passo 2-3 acima morvezes e para lavar os ovos até o sobrenadante é clara. Livrar-se de levedura residual é a chave nesta etapa. </li><li> Após a lavagem, drenar todo o sobrenadante até que o volume remanescente é de 2 ml. Alíquota de 32 ul de ovos em garrafas CT usando uma ponteira grande furo. Ovos na ponta da pipeta deve ser compacto, com pouco ou nenhum líquido aspirado. Isto pode ser alcançado através da inserção da ponta da pipeta em profundidade o assentamento de ovo e rapidamente libertar o êmbolo para aspirar. </li><li> Lugar semeado CT garrafas de volta na incubadora durante todo o desenvolvimento da mosca. </li></ol> 5. Recolha de Idade de correspondência adulto voa <ol><li> Adultos normalmente eclose a partir do dia 9 em diante. Descarte as moscas que surgiram no primeiro dia e garrafas lugar de volta na noite incubadora. Essa prática vai evitar a seleção inadvertida para emergentes iniciais e permitir a recolha de um número máximo de moscas sincronizados. </li><li> 16-22 horas mais tarde, transferir o adulto dias de idade voa intgarrafas de alimentos Ø 10% Sy. Se necessário, um outro lote podem ser recolhidos no dia seguinte. </li><li> Retorno voa de volta para a incubadora e permitir moscas para atingir a maturidade sexual e companheiro por dois dias. Gravar no dia da transferência para frascos de 10% SY como o primeiro dia de vida adulta. </li></ol> 6. Classificando Moscas e configuração Experimento Longevidade <ol><li> Anestesiar pequenos grupos de moscas sobre a almofada de anestésico, os machos e fêmeas de classificação em dois grupos, usando um pincel. Se usando CO 2, é fundamental para minimizar a exposição para evitar possíveis problemas de saúde de longa duração que podem comprometer a integridade da experiência longevidade. </li><li> Coloque 30 moscas do mesmo sexo em frascos individuais. Supondo que nenhum cromossomo balanceador na população e descendência saudável, cada garrafa deve produzir cerca de 3-4 frascos de cada sexo. Alíquotas de moscas em frascos individuais não deve durar mais do que 3-4 minutos, de modo que, no total, as moscas são apenas expostos a anestesia durante um máximo de9-10 min. </li><li> Repita os passos de 6,1-6,2 até que haja 8-10 frasco repetições para cada sexo e tratamento experimental. </li></ol> 7. Configurando a planilha Excel para controlar o Experimento Longevidade <ol><li> Recomendamos randomizar posição frasco, em vez de frascos de agrupamento por condição experimental, a fim de evitar imprecisões associadas à localização frasco dentro da incubadora e para obscurecer a identidade do frasco para o experimentador. Para fazer isso, primeiro atribuir um ID aleatório numérica para cada frasco em um programa de planilha, em seguida, organizar os frascos em bandejas por número de identificação. Se você estiver usando o software de gerenciamento de DLIFE experiência, siga o tutorial sobre configuração da experiência para gerar o número de identificação para cada frasco. </li><li> (Opcional) Se você estiver usando um leitor de RFID ou leitor de código de barras em associação com DLIFE, anexar uma tag RFID ou de código de barras a cada frasco e associar a marca com identificação numérica do frasco em DLIFE. O programa irá reconhecer cada frasco quando digitalizados com um leitore orientar uma para gravar os dados no local correto em uma planilha. O uso de um leitor de etiquetas em conjunto com DLIFE reduz significativamente os dados época de coleta e erro de gravação. </li></ol> 8. Manter o experimento Longevidade Os frascos contendo alimentos frescos devem estar à temperatura ambiente para cada transferência. <ol><li> Durante o período experimental, as moscas transferir para frascos contendo novos alimentos frescos cada 2 dias (fêmeas jovens), ou 3 vezes por semana (machos ou fêmeas&gt; 3 semanas de idade). Este passo assegura que o ambiente de alimentação para fêmeas jovens não é perturbada pela presença de larvas. Esta transferência deverá ser concluída sem anestesia, o que pode causar a morte aguda, especialmente em moscas mais velhas (Pletcher, observações pessoais). </li><li> Durante cada transferência frasco, registrar a idade, contar as moscas mortas no frasco de idade, e as moscas mortas que são transportados para o novo frasco. Grave esta informação separadamente emduas colunas em uma planilha (ou DLIFE ou sua própria planilha). Isto irá garantir que as moscas não são realizadas duas vezes contadas. O número total de mortes (mortos + realizada) deveria pelo menos igual ao número de moscas realizadas a partir da transferência anterior. Subtrair o número de moscas anteriormente desenvolvidas a partir do número total de mortes para determinar o número de mortes por novas. </li><li> Uma mosca é considerado certo-censurada se deixasse o experimento antes da morte natural através de fuga ou morte acidental. Animais saem da experiência desta forma deve ser inserido em uma coluna separada no dia em que a mosca saiu do experimento. Censurado moscas não são contabilizados como mortos (veja abaixo). </li><li> Continuar a repetir os passos 8,1-8,2 até o último sobrevivente está morto. Esteja ciente de que, como a idade moscas, algumas moscas podem mentir sobre a sua volta e aparecem mortos devido a sua inatividade. Portanto, quando a contagem moscas transportadas (morto), toque no lado dos frascos para determinar se existem movimentos das pernas. Se assim for, thesmoscas eletrônicos ainda estão vivos. No caso em que as moscas permanecem presos à comida no frasco de idade, mas vivos, eles não devem ser contados como mortos e deve ser resgatado por mais tocando do frasco para retirar a mosca. Censurando moscas que deve ser usado com cuidado, uma vez que pode resultar em viés experimental. </li></ol> 9. Análise de Dados <ol><li> A curva de sobrevivência mostra a probabilidade de que um indivíduo sobrevive para uma dada idade e normalmente é calculado usando uma abordagem de Kaplan-Meier (Figura 1) 8. Na ausência de dados da direita censurados, a fórmula pode ser simplificada tal que a sobrevivência específica da idade com a idade de x (S x) é determinado dividindo-se o número de indivíduos vivos no início de um período censo na idade x (N x) pelo número total de moscas no experimento (N 0) em que S x N x = / N 0. 9,2) Sobrevivência curvas são a forma mais comum de apresentação de dados, e elespode ser testado para a igualdade entre grupos usando um teste de log-rank. Inferência razoável pode ser desenhado a partir de tão pouco quanto 50-100 indivíduos de uma coorte. A sobrevivência é uma medida cumulativa, contudo, e, por conseguinte, que não são as mortes relacionadas com o envelhecimento, tais como os primeiros anos de vida, irá diminuir a sobrevivência ao longo do tempo de vida o que torna difícil a efeitos específicos para averiguar o envelhecimento. </li><li> Um método de visualização de dados é a segunda função de mortalidade específica por idade, o que mostra o risco de morrer por cada intervalo de idade e apresenta uma descrição mais matizada dos dados de sobrevivência 9,10. Medidas de mortalidade são independentes um do outro para a idade, e a forma da curva de mortalidade é útil para inferir sobre a dinâmica do envelhecimento, em particular quando os tratamentos são ajustados durante a vida adulta. Estimativas de mortalidade específicas por idade, no entanto, não têm precisão e exatidão com amostras pequenas, e muitas vezes exigem vários-para-muitos centenas de indivíduos por coorte para uma es confiáveltimate 11. </li><li> Outros métodos para estimar diferenças de longevidade incluem paramétrico (eg Gompertz) e semi-paramétricos (por exemplo, a regressão de Cox) modelos. Estes modelos podem ser poderosos, mas deve ser aplicado com cautela por causa das suposições feitas sobre a forma das curvas de mortalidade e da natureza dos efeitos do tratamento, o que poderia levar a inferência incorreta 11,12. </li></ol>

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui apresentado descreve um método para produzir medições reprodutíveis da longevidade da Drosophila, que é adaptável para a avaliação de intervenções farmacológicas, genéticos e ambientais. Aspectos cruciais do protocolo incluem controlando cuidadosamente o ambiente de desenvolvimento larval, minimizando o estresse do adulto, e minimizando o viés entre os grupos experimentais e controles. Apresentamos também a utilização do software de gestão DLIFE vida experiência. Por simplesme...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Levedura seca ativa </td><td> Fermento Fleishmann de </td><td> 2192 </td><td></td></tr><tr><td> Premix em Pó Uva Agar </td><td> Genesee Científico </td><td> 47-102 </td><td></td></tr><tr><td> Gaiolas grande coleção de Embriões </td><td> Genesee Científico </td><td> 59-101 </td><td></td></tr><tr><td> Tampas grandes substituição </td><td> Genesee Científico </td><td> 59-103 </td><td></td></tr><tr><td> 6 onças Praça Garrafas de fundo, de polipropileno </td><td> Genesee Científico </td><td> 32-130 </td><td></td></tr><tr><td> Tampas para garrafas Banco Flugs </td><td> Genesee Científico </td><td> 49-100 </td><td></td></tr><tr><td> DrosophilaFrascos, Geral, Polystrene </td><td> Genesee Científico </td><td> 32-117 </td><td></td></tr><tr><td> Closures Flugs para frascos largos </td><td> Genesee Científico </td><td> 49-101 </td><td></td></tr><tr><td> Largos Orifice Aardvark pontas de pipeta, 200 ul </td><td> Denville Científico </td><td> P1105-CP </td><td></td></tr><tr><td> Flystuff Flypad, tamanho padrão </td><td> Genesee Científico </td><td> 59-114 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 15 ml cónicas Tubos da centrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-70C </td><td></td></tr><tr><td> Pratos Fisherbrand Petri com Tampas Limpar, levantou cume, 100 OD x 15 mm H; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Kimax * Colorware frascos 1000 ml amarelo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-200-47 </td><td></td></tr><tr><td> PBS pH 7,4 10x </td><td> EmVitrogen </td><td> 70011044 </td><td></td></tr><tr><td> Agar Gelidium </td><td> Mooragar </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> Levedura de Cerveja </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0290331280 </td><td></td></tr><tr><td> Açúcar granulado </td><td> Kroger </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> Tegosept </td><td> Genesee Científico </td><td> 20-266 </td><td> Fly conservante de alimentos </td></tr><tr><td> Ácido propiónico, 99% </td><td> Acros Organics </td><td> 149300025 </td><td> Fly conservante de alimentos </td></tr><tr><td> Sulfato de canamicina </td><td> ISC BioExpress </td><td> 0408-10G </td><td></td></tr><tr><td> Tetraciclina HCl </td><td> VWR </td><td> 80058-724 </td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of lifespan in drosophila melanogaster

O envelhecimento é um fenômeno que resulta na deterioração fisiológica constante em quase todos os organismos em que foi examinado, levando à redução do desempenho físico e aumento do risco de doenças. Envelhecimento individual se manifesta ao nível da população como um aumento dependente da idade de mortalidade, que é muitas vezes medido em laboratório, observando vida em grandes grupos de indivíduos da mesma idade. Experiências que visam quantificar a extensão em que as manipulações genéticas ou ambientais impacto esperança de vida dos organismos modelo simples foram coroados de êxito para a compreensão dos aspectos do envelhecimento que são conservadas entre taxa e para inspirar novas estratégias para prolongar vida útil e prevenção de doenças associadas à idade nos mamíferos . A mosca do vinagre, Drosophila melanogaster, é um organismo modelo atractivo para estudar os mecanismos de envelhecimento devido ao seu tempo de vida relativamente curto, a criação conveniente, e genética fáceis.No entanto, medidas demográficas de envelhecimento, incluindo a idade específica de sobrevivência e mortalidade, são extremamente suscetíveis a variações ainda menores em delineamento experimental e meio ambiente, e para a manutenção de práticas estritas de laboratório para a duração dos experimentos de envelhecimento é necessária. Estas considerações, juntamente com a necessidade de praticar o controle cuidadoso do fundo genético, são essenciais para a geração de medições robustos. Na verdade, há muitas controvérsias em torno notáveis ​​inferência a partir de experimentos de longevidade em leveduras, vermes, moscas e ratos que foram traçadas a artefatos ambientais ou genéticos 1-4. Neste protocolo, descrevemos um conjunto de procedimentos que foram otimizados ao longo de muitos anos de medir a longevidade em Drosophila utilizando frascos de laboratório. Descrevemos também o uso do software DLIFE, que foi desenvolvido pelo nosso laboratório e está disponível para download ( <a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/ple</a>tcherlab / software). DLIFE acelera o rendimento e promove as boas práticas, incorporando melhor projeto experimental, simplificar a manipulação mosca e coleta de dados, padronização e análise de dados. Também vamos discutir as muitas armadilhas em potencial no projeto, coleta e interpretação de dados de expectativa de vida, e nós fornecemos medidas para evitar esses perigos.

Um esquema simplificado do protocolo é apresentada na Figura 1, em que os passos principais são delineadas. A parte do protocolo de sincronização podem ser utilizados para ensaios diferentes que necessitam de moscas adultas pareados por idade. As curvas de sobrevivência típicas de moscas do tipo selvagem são mostradas na Figura 2a, utilizando o software de gestão de DLIFE experiência (Figura 2b, c). Machos adultos geralmente vivem m...

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Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster é um organismo modelo eficaz para explorar a base molecular da regulação da longevidade. Este protocolo irá discutir as etapas envolvidas na criação de um reprodutível, medição de base populacional de longevidade, bem como potenciais armadilhas e como evitá-los.

Medição do Tempo de vida em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

measurement-of-lifespan-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

33.9K visualizações.  University of Michigan. Drosophila melanogaster é um organismo modelo eficaz para explorar a base molecular da regulação da longevidade. Este protocolo irá discutir as etapas envolvidas na criação de um reprodutível, medição de base populacional de longevidade, bem como potenciais armadilhas e como evitá-los.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biologia

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

De alta resolução de vídeo de Rastreamento Locomotion em Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Função de monitorização cardíaca em larval Drosophila melanogaster Para estudos fisiológicos

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissecção da Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Manutenção de um<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Gaiola População

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Medição da produção de dióxido de carbono da Radiolabeled Substratos em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...