Pesquisa financiada pela NSF prêmio MCB-1021384.

1. Preparação do Tampão Anaerobic <ol><li> Prepare 1 L de tampão fosfato 100 mM de potássio, pH 7,5. Verter 250 mL de tampão para um balão de 500-mL Büchner com uma barra de agitação. </li><li> Fechar bem o frasco com uma rolha de borracha e colocá-lo em uma placa de agitação. Ligue o tubo curto do balão a uma linha de Schlenk. </li><li> Degas tampão a sob vácuo durante 5 horas à temperatura ambiente com agitação. Durante este período de tempo, realizar 5 rodadas consecutivas de desgaseificação a vácuo e lavagem com argônio a cada hora. </li><li> Lavar o balão com argônio por 10 segundos e desligue-o da tubagem de vácuo. Colocar o balão no interior da caixa de luva. </li><li> Deixar o balão aberto na caixa de luva durante a noite com agitação vigorosa. </li></ol> 2. Remoção do oxigênio do sistema parou de fluxo <ol><li> Prepare 1 L de acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0. Verter 125 mL deste tampão para um balão de 250-mL Büchner e executar os passos 1,2-1,4. </li><li> Pesar 5mg oxidase de glicose a partir de Aspergillus niger (181,300 U / g) e 0,9 g de glicose utilizando um tubo Eppendorf de 1,5 mL e 50 mL Falcon tubo cónico, respectivamente. Coloque os dois recipientes no porta-luvas. </li><li> Dissolve-se a glicose oxidase e glucose em 50 mL de acetato de anaeróbio de sódio 0,1 M, pH 5,0 (concentrações finais de 18,13 U / mL e 100 mm, respectivamente). Encha as seringas reservatório com esta solução (Figura 1). </li><li> Certifique-se que as válvulas do motor estão no a &quot;carga&quot; de posição e preencher as seringas unidade (Figura 1). Gire a válvula de F para o &quot;drive&quot; de posição. Esvazie a seringa parar clicando no Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre o tampão de F seringa unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a memória RAM da unidade correspondente. Repetir este passo dez vezes no total. Execute o mesmo procedimento com os outros três seringas de unidade. Espere uma hora. </li><li> Substituir a solução das seringas reservatório com o mesmo tampão containing glicose oxidase e glucose. Repita o passo 2.4. </li><li> Repetir o passo 2,5 e permitir que a solução em repouso no sistema de fluxo durante a noite. </li><li> Após a incubação durante a noite, repita o passo 2.5. </li></ol> 3. Preparação do Tampão de oxigênio saturado <ol><li> Preparar 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,5) e deitar 50 mL para um frasco de 50 ml com uma barra de agitação. Tapar o frasco com uma rolha de Wheaton e um selo de alumínio Wheaton. </li><li> Colocar o frasco em gelo. Mergulhar uma agulha longa ligado a um tanque contendo 100% de oxigénio na solução. Insira outra agulha curta através da tampa do frasco como um respiradouro. </li><li> Solução a bolha de oxigénio a 100% durante 1 hora com agitação. </li><li> Primeiro, remova a agulha curta do frasco e aguarde 10 segundos antes de remover a agulha longa. Colocar o frasco fechado na caixa de luva. </li></ol> 4. Preparação da solução de NADPH <ol><li> Pesar 1 mg de NADPH num tubo Eppendorf de 1,5 mL e colocar it para o porta-luvas. </li><li> Dissolve-se o NADPH em 300 uL de anaeróbio 100 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,5. Remover 30 uL desta solução a partir da caixa de luva para determinar a concentração de NADPH com um espectrofotómetro (ε 340 nm = 6.270 M -1 cm -1). </li></ol> 5. Remoção de oxigénio da solução de enzima <ol><li> Tome 400 uL de solução de estoque de enzima a partir do congelador e descongelamento na caixa de luva. A solução-mãe da enzima (360 uM) foi previamente preparado em tampão fosfato 100 mM de potássio (pH 7,5) contendo 100 mM de NaCl, e congelados em azoto líquido. </li><li> Transferir a solução de enzima para um frasco de 25 mL com uma barra de agitação, limitar o frasco com uma rolha de Wheaton e um selo de alumínio Wheaton e remover a partir da caixa de luva. </li><li> Coloque o frasco no gelo e conectá-lo a uma linha Schlenk inserindo uma agulha através da tampa do frasco. </li><li> Desgaseificar a solução de enzima através da realização de 5 rodadas consecutivos dede desgaseificação a vácuo e lavagem com árgon a cada 20 minutos durante 1 hora. </li><li> Lave o frasco com argônio por 10 segundos e desligue-o da tubagem de vácuo. Coloque o frasco em gelo no interior do porta-luvas. </li></ol> 6. Redutora semi-reação: Redução Flavin Monitoramento <ol><li> Preparar o instrumento stopped-flow e do software de controlo Pro-Dados para o modo de mistura único seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Ligue um banho de água circulante (15 ° C). Remover o oxigénio a partir da água por borbulhamento de azoto através dele durante 20 minutos. Isto impede a contaminação de oxigénio através do circuito de fluxo. </li><li> Manter a temperatura das seringas de unidade ea célula de observação a 15 ° C através da ligação do invólucro banho de água do stopped-flow para o banho de circulação. </li><li> Na janela Painel de controle do controle de matriz software Pro-Data Photodiode select, trigger externo (para ativar a parada do fluxo de operação), e Logaritescala hmic. </li><li> Inicie o software de visualização Pro-Data e definir o diretório onde os arquivos de dados serão armazenados. </li><li> Substituir a solução de reservatório seringas C e F com anaeróbio tampão fosfato 100 mM de potássio (pH 7,5). Gire o C e F válvulas para o &quot;drive&quot; de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre o tampão de ambas as seringas a unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a unidade correspondente ram cinco vezes no total (clique em Esvaziar antes de cada movimento do carneiro). </li><li> A fim de assegurar que a glucose oxidase foi completamente removido a partir do circuito de fluxo, realizar o passo 6.6 quatro vezes no total. </li><li> Clique na linha de base no software de controle Pro-Data. </li><li> Misturar 100 uL de solução de estoque de enzima com 1100 uL de anaeróbio 100 mM de tampão fosfato de potássio (concentração final após a mistura no fluxo parado de 15 uM). </li><li> Substituir a solução de reservatório syrF Inge com a solução de enzima. Gire a válvula de F para o &quot;drive&quot; de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre a solução de enzima a partir de F seringa unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a memória RAM da unidade correspondente. Realizar esta três vezes no total. No software de controle Pro-Data, definir o tempo de aquisição de 60 s. </li><li> Certifique-se que ambas as seringas unidade são preenchidos com as soluções correspondentes e carneiros da unidade estão em contato com os pistões de seringa de unidade. Vire ambas as válvulas para o &quot;drive&quot; e clique em Adquirir posição no software de controle Pro-dados para realizar a unidade. Repetir este passo mais duas vezes para obter os dados em triplicado. Este espectros rendimentos da forma oxidada da enzima. </li><li> Usando o Um valor nm 452 obtido a partir das unidades, determinar a concentração de enzima antes da mistura (ε 452 nm = 13.700 M -1 cm -1) e preparar 4 mL de uma soluçã NADPHn de 1,5 vezes mais concentrado. </li><li> Substituir a solução de reservatório seringa C com a solução de NADPH e vazias e de recarga da seringa paragem três vezes tal como descrito em 6,10. </li><li> Repita o passo 6.11. Este espectros rendimentos durante a redução da enzima. </li></ol> 7. Oxidativo semi-reação: Oxidação Flavin Monitoramento <ol><li> Preparar o instrumento stopped-flow e do software de controlo Pro-Dados para o modo de mistura duas vezes seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Repita os passos 6.2-6.5. </li><li> Substituir a solução nas quatro seringas reservatório com anaeróbio tampão fosfato 100 mM de potássio (pH 7,5). Gire a válvula de F para o &quot;drive&quot; de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurre o tampão da seringa F unidade através do circuito de fluxo manualmente, aumentando a memória RAM da unidade correspondente. Executar este passo cinco vezes, no total, com cada unidade de seringa. </li><li> Execute o passo 7.3 quatro vezes em total de remover completamente o conteúdo a partir do circuito de fluxo. </li><li> Clique de linha de base no software de controlo Pro-Dados. </li><li> Misturar 200 uL de solução de estoque de enzima com 1000 uL de anaeróbio 100 mM de tampão fosfato de potássio (concentração final após a mistura no fluxo parado de 15 uM). </li><li> Substituir a solução de seringa reservatório A com a solução de enzima. Gire a válvula A para o &quot;drive&quot; de posição. Esvazie a seringa parada clicando Vazio no software de controle Pro-Data. Empurrar a solução de enzima a partir de seringa unidade A através do circuito de fluxo por manualmente elevar o carneiro unidade correspondente. Executar este passo três vezes no total. No software de controle Pro-Data, definir o tempo de atraso de 0,5 s e tempo de aquisição de 60 s. </li><li> Garantir que todas as seringas unidade são preenchidos com as soluções correspondentes e carneiros unidade estão em contato com os pistões de seringa de unidade. Ligue todas as válvulas para o &quot;drive&quot; e clique em Adquirir posição na Pro-Datum software de controlo para executar a unidade. Repetir este passo mais duas vezes para obter os dados em triplicado. Este espectros rendimentos da forma oxidada da enzima. </li><li> Substituir a solução de seringa reservatório B com uma solução de NADPH 1,5 vezes mais concentrada do que a solução de enzima em seringa A. Rode a válvula B para o &quot;unidade&quot; posição e vazio e reenchimento da seringa paragem três vezes, conforme descrito em 7.7. </li><li> Substituir a solução de reservatório seringa C com tampão oxigenado. Gire a válvula C para o &quot;drive&quot; posição vazia e encher a seringa parar três vezes como descrito em 7.7. No software de controle Pro-Data, definir o tempo de atraso e aquisição de 15 e 900 s, respectivamente. </li><li> Repita o passo 7.8. Este espectros rendimentos durante a reoxidação da enzima completamente reduzida. </li></ol> 8. Análise de Dados <ol><li> Inicie o software do conversor Pro-Data. Clique no ícone Opções e selecione Salvar em ProDataCSV. </li><li> Abertoo diretório onde os arquivos de dados foram armazenados. Arraste os arquivos para a janela do conversor Pro-APL de dados. Os dados serão salvos automaticamente como arquivos no formato CSV no mesmo diretório. </li><li> Abra os arquivos no formato CSV usando o Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EUA). Normalizar a linha de base dos traços de stopped-flow subtraindo a absorção correspondente a 700 nm. </li><li> Analisar os vestígios corrigida utilizando KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) por meio de ajuste da trama da absorvância no máximo correspondente versus tempo para a função apropriada exponencial. Como mostrado na Figura 2B, a absorvância a 452 nm foi representada graficamente como uma função do tempo, a fim de determinar a taxa de redução de flavina após a mistura da enzima e NADPH no instrumento de stopped-flow. Neste caso, o melhor ajuste dos dados foi obtida usando uma equação exponencial dupla e as taxas de 0,65 e 0,23 s -1 foram calculados para a primeira fase ea segunda parte da redução, respectivamente. Para determinar a taxa de formação do intermediário C4a-hydroperoxyflavin ea reoxidação depois reagir o enzima reduzida com oxigénio, foram analisados ​​os vestígios de stopped-flow a 380 e 452 nm, respectivamente (Figura 3B). Usando uma equação exponencial simples, calculou-se as taxas de 1,4 e 0,006 s -1 para o primeiro passo e do segundo oxidativo semi-reacção, respectivamente. </li></ol> 9. Os resultados representativos Os resultados das experiências descritas nas secções anteriores mostram como o redutiva semi-reacção de A Sida f pode ser monitorizada medindo as mudanças na absorvância a 452 nm, que correspondem às alterações no estado redox da flavina. A taxa de este passo pode ser determinado pelo ajuste dos dados à equação apropriado (Figura 2; Passo 8,4). A taxa de redução obtida (0,65 s -1) é semelhante ao valor calculado com kcatde estado estacionário experiências 2, sugerindo que a redução é o passo determinante da taxa da reacção. Tirando vantagem do modo de dupla mistura do stopped-flow, a taxa de oxidação e os intermediários neste semi-reacção pode ser determinada (Figura 3; Passo 8,4). Na reacção catalisada por um Sida f, o C4a-hydroperoxyflavin é claramente detectado (λ max de 380 nm), e da taxa de formação e de decaimento pode ser calculada. A taxa lenta do reoxidação obtido (0,006 s -1) indica que o C4a-hydroperoxyflavin é muito estável na ausência do ornitina. <img alt="Esquema 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> Mecanismo Esquema 1. De A Sida f. O anel isoallozaxine do cofactor FAD é mostrado. A flavina oxidada (A) se liga a NADPH (B) e reage para formar flavina reduzida e NADP + (C). Após reação com o oxigênio molecular e ligação deornitina, o C4a-hydroperoxyflavin é formado (D). Esta é a espécie de hidroxilação. Depois de hidroxilação de ornitina, o hydroxyflavin (E) deve ser desidratado para formar a enzima oxidado. NADP + mantém ligado durante todo o ciclo catalítico e é o último produto a ser libertada (F). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Figura 1. O instrumento de stopped-flow. A) Imagem de os componentes do Fotofísica Aplicada SX20 parou-fluxo espectrofotómetro. B) Imagem da unidade de manipulação da amostra. C) Esquema do circuito de fluxo no modo de mistura de casal. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Figura 2. Redução anaeróbia de Sida com NADPH no instrumento de stopped-flow. A muda) espectrais registrados após a mistura de volumes iguais de 30 mm Sida e 45 mM NADPH. O primeiro espectro (oxidado Sida) e espectro última (totalmente reduzida SidA) é destacada em azul e vermelho, respectivamente. B) de rastreio de absorvância a 452 nm registadas como uma função do tempo. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Figura 3. Oxidação de Sida no instrumento de stopped-flow. A) mudanças espectrais registada após a mistura de volumes iguais de a Sida totalmente reduzido e tampão oxigenado. As concentrações finais foram de 15 mM Sida, 22,5 mM NADPH, oxigênio e 0,95 mM. O espectro registado no 0,034, 4,268, e 727,494 s corresponde à enzima completamente reduzido, o intermediário C4a-hydroperoxyflavin (λ max de 380 nm), ea enzima oxidado (λ max de 450 nm), respectivamente. B) de rastreio de absorvância a 382 nm e 452 registadas como uma função do tempo.

<ol>
	<li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA,+encoding+L&#45;ornithine+N5&#45;oxygenase,+is+required+for+virulence.">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L&#45;ornithine N5&#45;oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li><li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor.">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li><li>Mayfield, J. 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V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments.">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Enzimas que catalisam reacções redox geralmente contêm cofactores tais como hemes e flavinas que sofrem alterações significativas de absorvância durante o ciclo catalítico. A forma oxidada do flavina apresenta absorvância máxima a ~ 360 e 450 nm, ea sua redução é tipicamente monitorizada por acompanhando a diminuição da absorvância a 450 nm 7. Em geral, alguns intermediários transientes estão presentes, mas forma e decadência rápido demais para ser medido em espectrofotômetros regulares. Usando o Fotofísica Aplicada SX20 stopped-flow espectrofotômetro (ou instrumentos semelhantes), é possível medir as mudanças de absorbância na escala de tempo de milissegundos (tempo morto, 2 ms). Aqui estudamos as redutoras e oxidativa semi-reações da flavina monooxigenases dependentes de A Sida f, servindo como um modelo. A taxa de transferência de hidreto foi determinada pela medição da mudança de absorvância a 452 nm após a mistura da enzima com NADPH em condições anaeróbias. Subsequentemente, tendo advantagE de modo duplo de mistura do instrumento de stopped-flow, a enzima foi primeiro feito reagir com NADPH, até que a redução total foi alcançado, então o enzima reduzida-NADP + complexo foi misturado com oxigénio. Seguindo este procedimento, é possível detectar transientes intermediários flavina oxigenados e para medir as taxas de formação e decomposição. A identificação destes intermediários fornece dados experimentais sobre a natureza das espécies reagentes em catálise. No caso de A Sida f, a formação do C4a-hydroperoxyflavin (tipicamente monitorizada a 370-380 nm), que é a espécie de hidroxilação. Além disso, a medição da taxa constante de cada etapa permite a obtenção de uma informação sobre o passo determinante da taxa da reacção e ajudar a elucidar os mecanismos cinéticos e químicas da enzima. Em geral, as abordagens semelhantes podem ser utilizados para flavoenzimas outros, ou proteínas para as quais absorvância as alterações ocorreram, tais como proteínas que contain heme, o fosfato de piridoxal-ou não-heme 8-10. Uma limitação deste método é que grandes quantidades de enzima purificada são necessários, mas isto pode ser ultrapassada pela utilização de um sistema de expressão com rendimentos elevados. Um determina a concentração de proteína óptima para espectros de gravação usando proteína suficiente para que um sinal forte o suficiente pode ser observado, mas não demasiado de modo que a enzima não é desperdiçado. Tipicamente, a menor concentração de enzima para flavina contendo enzimas usadas em stopped-flow experiências é 6-10 iM (após mistura) e é determinada utilizando o coeficiente de extinção molar correspondente da enzima. No caso de A Sida f, a percentagem do FAD enzima ligada é 50-65% 2. Apo-proteína é considerada como inactiva nestas experiências, porque um cofactor FAD ligado é necessária para a catálise. Outra limitação possível para este método é que se os processos em uma enzima ocorrer mais rapidamente do que 2 ms (tempo morto do stopped-flow) que não será observado, mas there são relatados onde as taxas de estratégias pode ser reduzida para superar esse problema. Um exemplo para este inclui a utilização de uma elevada concentração de NaCl na reacção de um ferredoxina-NADP + redutase 11. A lavagem de oxigénio a partir do circuito de fluxo do stopped-flow é muitas vezes um passo complicado nesta experiência e requer uma atenção especial. A glicose oxidase de glicose sistema descrito aqui é utilizado com sucesso na maioria dos laboratórios como é um método eficaz e de baixo custo. No entanto, existem algumas desvantagens, que incluem a produção de H2O 2 e para algumas aplicações outras alternativas como o sistema de dioxigenase protocatecuato-protocatecuato deve ser considerada 12. A utilização de uma caixa de luva anaeróbio torna mais fácil para assegurar condições anaeróbias, mas não é essencial. De oxigénio deve ser removido a partir do circuito de fluxo do stopped-flow como queremos a enzima de ser reduzido na ausência de oxigénio ou de reagir com o oxigénio a uma concentraçãos que especificar. Embora o stopped-flow é na caixa de luva, há oxigénio no circuito de fluxo, se utilizado buffers aeróbias em experiências anteriores. Além disso a medições de absorvância, ensaios de fluorescência e dicroísmo circular pode ser realizada na Applied Fotofísica SX20 espectrofotómetro stopped-flow com os acessórios correspondentes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Geral Equipamentos de Laboratório </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Bomba de vácuo </td><td> Ludibriar </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner frascos </td><td> Pescador </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Mexa bares </td><td> Pescador </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Mexa placas </td><td> Pescador </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk linhas </td><td> Kontes Glass </td><td> - </td></tr><tr><td> Argon tanque </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Tanque de nitrogênio </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> Tanque de nitrogênio, grau de pureza ultra alta </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Tanque de oxigênio </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% de hidrogênio do tanque de nitrogênio equilíbrio </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 Stop fluxo de espectrofotômetro </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Porta-luvas </td><td> Recatado </td><td> - </td></tr><tr><td> Banho-maria </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Abastecimento </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mL BD Falcon tubos </td><td> Pescador </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 mL BD Falcon cônico tubos </td><td> Pescador </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1,5 mL de microcentrífuga tubos Eppendorf </td><td> Pescador </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 e 25 frascos de vidro mL </td><td> Pescador </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Rolhas de borracha </td><td> Pescador </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Selos de alumínio </td><td> Pescador </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagents </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> Pescador </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio dibásico </td><td> Pescador </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> Acetato de sódio </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> Oxidase de glicose a partir de A. Níger </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Pescador </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β NADPH- </td><td> Pescador </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-Ornitina cloridrato </td><td> Pescador </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus sideróforo A (Sida) é um mono-oxigenase-FAD contendo que catalisa a hidroxilação de ornitina na biossíntese de sideróforos hidroxamato que são essenciais para a virulência (por exemplo, ferricrocin ou N &#39;, N », N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1. A reacção catalisada por Sida pode ser dividida em redutivas e oxidativa semi-reacções (Esquema 1). No redutiva semi-reacção, o FAD oxidado ligado a um Sida f, é reduzida por NADPH 2,3. No oxidativo semi-reacção , o cofactor reduzida reage com oxigénio molecular para formar um intermediário C4a-hydroperoxyflavin, que transfere um átomo de oxigénio a ornitina. Aqui, nós descrevemos um processo para medir as taxas e detectar as diferentes formas espectrais de Sida utilizando um instrumento de stopped-flow instalado no uma caixa de luva anaeróbio. No instrumento stopped-flow, pequenos volumes de reagentes são rapidamente misturados, e depois de o fluxo é parado por the seringa de paragem (Figura 1), as alterações espectrais da solução introduzida na célula de observação são registadas ao longo do tempo. Na primeira parte do experimento, vamos mostrar como podemos usar o instrumento parou de fluxo em modo único, onde a redução anaeróbia da flavina em A Sida f por NADPH é medida diretamente. Em seguida, usamos duplas configurações de mistura onde A Sida f é primeiro anaerobicamente reduzidas por NADPH durante um período de tempo designado, em um circuito de envelhecimento e, em seguida feito reagir com oxigénio molecular na célula de observação (Figura 1). A fim de realizar esta experiência, os buffers anaeróbias são necessários porque quando somente o redutiva semi-reacção é monitorizada, qualquer oxigénio nas soluções irão reagir com o cofactor flavina reduzida e formar um intermediário C4a-hydroperoxyflavin que acabará por decair de volta para o flavina oxidada . Isso não permitiria que o usuário para medir com precisão as taxas de redução, pois não haveria volume de negócios total da enzYme. Quando o oxidante meia de reacção está a ser estudada a enzima deve ser reduzida na ausência de oxigénio de modo a que apenas os passos entre a redução e oxidação são observados. Um dos buffers utilizados no experimento é saturado de oxigênio para que possamos estudar a oxidativo semi-reação em altas concentrações de oxigênio. Estes são frequentemente os procedimentos realizados quando se estuda tanto as redutoras ou oxidativo semi-reações com flavina monooxigenases contendo. A escala de tempo dos experimentos pré-de estado estacionário realizados com o stopped-flow é milissegundos para segundos, que permitem a determinação de constantes de velocidade intrínsecos e de detecção e identificação de intermediários na reacção 4. Os procedimentos aqui descritos podem ser aplicados a outras flavina-dependentes monooxigenases 5,6.

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Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Nós descrevemos o uso de um instrumento de stopped-flow a investigar as redutivas e oxidativa semi-reacções de<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; Sideróforos A (Sida), uma flavina monooxigenases dependentes. Em seguida, mostram os espectros correspondente às espécies na reacção de SIDA e calcula-se as constantes de velocidade para a sua formação.

Monitorar os redutivas e oxidativo semi-reações de um Monooxigenase Flavin-Dependent usando stopped-flow Espectrofotometria

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

monitoring-reductive-oxidative-half-reactions-flavin-dependent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K visualizações.  Virginia Polytechnic Institute and State University. Nós descrevemos o uso de um instrumento de stopped-flow a investigar as redutivas e oxidativa semi-reacções de Aspergillus fumigatus Sideróforos A (Sida), uma flavina monooxigenases dependentes. Em seguida, mostram os espectros correspondente às espécies na reacção de SIDA e calcula-se as constantes de velocidade para a sua formação.

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Bioengenharia

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the arterial wall lead to tissue injury, which initiates restenosis2-7. This hypothesis needs further investigations including better quantifications of non-uniform strain distribution on the artery following stent implantation. A non-contact surface strain measurement method for the stented artery is presented in this work. ARAMIS stereo optical surface strain measurement system uses two optical high speed cameras to capture the motion of each reference point, and resolve three dimensional strains over the deforming surface8,9. As a mesh stent is deployed into a latex vessel with a random contrasting pattern sprayed or drawn on its outer surface, the surface strain is recorded at every instant of the deformation. The calculated strain distributions can then be used to understand the local lesion response, validate the computational models, and formulate hypotheses for further in vivo study.

Stent-induced arterial strain distributions are characterized using an optical surface strain measurement system. This visualization technique is used to gain insights into the impact of stent implantation on the host vessel.

Monitorização da Mecânica de parede durante a implantação de stent em um vaso

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoramento em Tempo Real de intracelular Bile Ácido Dynamics usando um sensor Ácido Bile baseado em FRET codificados geneticamente

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Cateter de luz de queima lateral intra-cardíaco para monitoramento do metabolismo celular usando espectroscopia de absorvência transmural de corações de mamíferos perfused

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental technique and image analysis protocol presented here can also be applied for imaging microscopic bubbles in other fields of research; therefore, it has a wide range of applications. We apply this to image cavitation around dental ultrasonic scalers. It is important to image cavitation to characterize it and to understand how it can be exploited for various applications. Cavitation occurring around dental ultrasonic scalers can be used as a novel method of dental plaque removal, which would be more effective and cause less damage than current periodontal therapy techniques. We present a method for imaging the cavitation bubble clouds occurring around dental ultrasonic scaler tips using a high-speed camera and a zoom lens. We also calculate the area of cavitation using machine learning image analysis. Open source software is used for image analysis. The image analysis presented is easy to replicate, does not require programming experience, and can be modified easily to suit the application of the user.

Cavitation microbubbles are imaged using a high-speed camera attached to a zoom lens. The experimental setup is explained, and image analysis is used to calculate the area of the cavitation. Image analysis is done using ImageJ.

Imagem e quantificação da área de microbolhas em movimento rápido usando uma câmera de alta velocidade e análise de imagem

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.