1. Puxando micropipetas de vidro Equipamento: Micropipeta Puller, Microforge. Vidro: Boroscillicate capilares de vidro (~ 1,5 mm de diâmetro externo, diâmetro interno de 1,4 mm ~). <ol><li> Micropipetas são puxados usando a mesma abordagem básica que é usada para preparar microeletrodos de vidro para gravações de eletrofisiologia. Resumidamente, um capilar de vidro é aquecido no meio e, quando o vidro começa a derreter as duas metades do tubo capilar são separadas gerando duas micropipetas. Vários puxadores comerciais estão disponíveis para executar esse processo varia de relativamente simples puxadores verticais que usam a gravidade para puxar as duas pipetas para além de altamente sofisticados puxadores horizontais que oferecem várias opções programáveis ​​para variar a velocidade e outros parâmetros da atração. Ambos os tipos de extractores foram usadas nas nossas experiências. </li><li> Exigências para a geometria da ponta de pipeta: As pontas das pipetas utilizados nestas experiências normalmente variam entre 2 a 6 um diâmetro exterior, dependendo do tamanho da célula. Outro parâmetro importante é a forma da ponta, o que deve aproximar um tubo cilíndrico (ver Figura 1). Isto pode ser conseguido através da optimização dos parâmetros do puxão e verificar a forma da ponta sob o microscópio até que a forma desejada é obtida. O comprimento óptimo da haste pipeta depende da quantidade de deformação esperada: se as deformações são pequenas &lt;10 uM, é o suficiente para que a parte do cilindro do tipo da pipeta também é relativamente curto (da mesma ordem de magnitude), para maior deformações ajustar em conformidade. Em geral, o aumento do calor e / ou aumento de &quot;puxar&quot; diminui o diâmetro da ponta. O aumento de &quot;pull&quot; também gera uma ponta com um longo cone. Nas nossas experiências, utilizando um Sutter P-97 da pipeta horizontal puxador, o programa foiotimizado para os seguintes parâmetros: Calor de 473; Pull 22, velocidade de 22, 200, pressão de tempo 500. É também possível criar pontas cilíndricos puxando por uma haste longa e, em seguida, romper e polimento. Instruções detalhadas sobre como preparar os diferentes tipos das pipetas são dadas no manual Sutter. </li><li> Microforge: Também é recomendado para disparar-polir a ponta da pipeta para gerar uma superfície de vidro liso que faz uma boa vedação com a membrana plasmática. Isto é feito, trazendo a ponta da pipeta com a proximidade de uma esfera de vidro aquecida para a muito uma fracção de um segundo, utilizando uma microforge. Técnica semelhante é usada rotineiramente para preparar microeletrodos para registros eletrofisiológicos. </li><li> Encher o Micropipeta: Micropipetas deve ser preenchido com uma solução salina fisiológica, tal como PBS ou meio de crescimento não-fluorescente. Importante, a solução deve ser suplementado com soro a 30%, que irá permitir que o mem célulaBrane a mover-se suavemente na pipeta. Duas abordagens podem ser utilizadas para se livrar das bolhas de ar na ponta da pipeta: (i) uma ponta da pipeta pode ser imersa na primeira solução para permitir que o líquido para encher a ponta pelas forças de capilaridade seguido de preenchimento da pipeta do outro lado, ou (ii) toda a pipeta pode ser enchido a partir da extremidade traseira batendo suavemente na haste da pipeta para remover as bolhas a partir da ponta. </li><li> Nota: As pipetas devem ser preparadas no dia da experiência. </li></ol> 2. Preparação de Células <ol><li> Semeando as células: Microaspiração é realizada em células individuais, que são ou mantidos em suspensão ou estão ligados ao substrato. Para aspirar as células em suspensão, as células são levantadas dos seus substratos e pipetada para uma câmara longitudinal superficial, que é montado sobre o microscópio invertido imediatamente antes da experiência. Para aspirar substrato anexados células, as célulassão semeadas em pequenos cover-desliza (mm ~ 10 diâmetro), que também pode ser colocado dentro da câmara de micro-aspiração antes da experiência. O racional para usar uma câmara longitudinal superficial é o de permitir uma micropipeta para aproximar as células em um ângulo muito raso, o mais próximo da horizontal quanto possível. Isto é feito para permitir que a membrana puxado para dentro da micropipeta para ser visualizado em um único plano de foco (ver Figura 2). </li><li> A visualização da membrana celular: Para observar a projecção da membrana para a pipeta, as membranas celulares são marcadas com um corante lipofílico fluorescente, tal como dii utilizando um protocolo de coloração convencional. <ol type="i"><li> Solução PBS quente. </li><li> Dilui-se a DII estoque para uma concentração de trabalho (5 uM) com a solução de PBS aquecido. </li><li> Sonicar durante 5 min a quebrar agregados de corante. </li><li> Spin para baixo por 5 minutos e tomar sobrenadante. </li><li> Lave as células em PBS três vezes, 5 min cada. </li><li> Incubar as células com o corante de modolução durante 30 min numa incubadora a 37 ° C. </li><li> Lavar as células com PBS 3 vezes durante 5 minutos cada. </li></ol></li><li> Nota: É possível substituir DII coloração da membrana com a visualização do citoesqueleto da membrana sub-que também está a ser puxado em conjunto com a membrana para a pipeta. Ele tem de ser tido em conta, no entanto, que, perturbando o citoesqueleto pode alterar as propriedades biomecânicas da célula. Além disso, ao realizar experiências com células de substrato microaspiração anexas, recomenda-se a utilização de imagens 3D para estimar o comprimento da projecção da membrana para a pipeta, que é posicionado a um ângulo em relação ao plano focal das células. </li></ol> 3. Microaspiração e Aquisição de Imagens Equipamento: microscópio de fluorescência invertido, de preferência com capacidades de deconvolução 3D (Zeiss Axiovert 200M com computador controlado movimento do eixo Z da objetividadees ou equivalente); câmera de vídeo conectada a um computador (AxioCam MRM ou equivalente), transdutor de pressão (BioTek ou equivalente), sem vibração estação (DTM ou equivalente), micromanipulador (Narishige, Sutter, Burleigh ou equivalente; manipuladores podem ser mecânicos, hidráulicos ou piezoeléctrico). É também importante salientar que a microaspiração pode ser realizada usando um microscópio sem capacidades 3D para estimar a rigidez das células em suspensão, tais como as células de sangue vermelho 1,2 ou 3, organelas neutrófilos isolados, tais como os núcleos 4 ou lipossomas artificiais 5. Software de aquisição de imagem: Zeiss AxioVision ou equivalente. <ol><li> Montar as células para uma câmara de micro-aspiração, como descrito acima, em um microscópio invertido de fluorescência. Posicionar as células escolha de uma célula para uma experiência e colocá-lo no centro do campo visual. É importante para perform destas experiências estão em um ambiente livre de vibrações, em particular para as experiências com células-substrato anexado porque vibrações minúsculas que normalmente ocorrem em bancos e mesas regulares são susceptíveis de comprometer completamente a criação do selo, quebrar a ponta da micropipeta ou resultar em mudanças significativas na posição da ponta que vai distorcer a análise dos resultados. </li><li> Coloque uma micropipeta cheia de PBS / media w / solução de soro num suporte de pipeta ligada a um transdutor de potência por meio da tubagem flexível com o diâmetro ajustado ao conector do suporte da pipeta para um ajuste apertado. No início de cada experiência, a pressão na pipeta é equilibrada com a pressão atmosférica. A pipeta é montado sobre um micromanipulador que permite um bom controle dos movimentos da pipeta num intervalo micron. Posicionar uma pipeta num ângulo raso para o fundo da câmara e trazer a ponta da pipeta para o centro do campo visual. Thhaste e da pipeta, uma parte cilíndrica da ponta da pipeta na qual a membrana é aspirado, é alinhado horizontalmente ao plano focal por (1) o posicionamento da pipeta no ângulo mais raso possível (10-15 °) e (2) pelo flexão da haste da pipeta contra o fundo da câmara. Porque a haste é muito fina é suficientemente flexível para se deslizar sobre o fundo da câmara quando se aproxima de uma célula, tal como mostrado esquematicamente na Figura 1. Lentamente trazer para baixo a micropipeta para o lado de uma única célula utilizando o manipulador de curso até próximo do plano de foco para a célula. Em seguida, utilizando um manipulador fino mover a micropipeta com a extremidade da célula, até a ponta da pipeta toque suavemente a membrana. Tomar uma imagem para observar a posição da pipeta. Selos bons são criadas quando a ponta da pipeta de todo se encontra em contacto completo com a superfície da célula e o contacto é estável. Não há nenhum critério objetivo forte, porém, sobre como é bom o selo é excEPT para o exame visual. </li><li> Aplicar um passo de pressão negativa através do transdutor e mantê-la até projecção membrana é estabilizado. A quantidade de pressão necessária para aspirar a membrana para a pipeta varia dependendo do tipo de célula e condições experimentais específicas. Nas nossas experiências, a deformação inicial é normalmente observado quando se aplica pressão na gama entre 2 a Hg-15mm. Quando a pressão é aplicada, a membrana é deformada progressivamente para a pipeta até que seja estabilizada no comprimento certo, um processo que normalmente demora de 2-3 min. Durante este tempo, as imagens de deformação da membrana são adquiridos a cada 30 seg para monitorar a progressão da membrana, que é puxado para dentro da pipeta. </li><li> Aumentar a pressão para o nível seguinte de 2-5 mm de Hg passos e repetir todo o processo de projecção de membrana até que se destaca a partir da célula e move-se para a pipeta, altura em que o ensaio é interrompido. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Análise Para quantificar o grau de deformação da membrana, o comprimento aspirado (L) é medido a partir da ponta da pipeta para o vértice da periferia da projecção de membrana. É importante notar, contudo, que a maior pipeta aplicar mais força sobre a membrana da célula no mesmo nível de pressão. Para levar em conta a variabilidade entre os diâmetros das pipetas, portanto, o comprimento aspirado é normalizado para o diâmetro da pipeta (D) medido para cada experimento. Os dados podem ser analisados ​​utilizando um padrão linear viscoelástico modelo semi-espaço da célula endotelial, como descrito em estudos anteriores 6,7. Especificamente, o módulo de elasticidade das células foi estimada utilizando a equação: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886eq1.jpg" /> onde E é o módulo de Young, a é o interiorraio da pipeta, Ap é a diferença de pressão, L é o comprimento correspondente aspirado, e φ (η) é uma parede de funcionar calculado utilizando o modelo de força, tal como descrito por Theret et al 7. É importante notar que vários modelos têm sido utilizados para analisar os dados microaspiração incluindo um modelo de elemento finito, que assume que a célula é uma esfera deformável com as propriedades do material isotrópico e homogéneo e modelos gota de líquido, que assumem que as células formam uma forma esférica, pode deformar-se de forma contínua, e recuperar depois da libertação, conforme descrito em várias excelentes revisões: 8-10. Microaspiração também pode ser usado para investigar outros parâmetros biomecânicos de células e tecidos, tais como as propriedades viscoelásticas celulares, tensão cortical e contribuição de diferentes elementos estruturais de células e de tecidos biomecânica (ver as revisões listados acima para obter mais informação). 5. RepresentanteResultados Em estudos anteriores, a aspiração micropipeta foi realizada quer em lipossomas 5 ou sobre as células que não estavam ligados ao substrato de 2,11-13. Nos nossos estudos, no entanto, as células são tipicamente mantida ligada ao substrato a fim de evitar as alterações na estrutura do citoesqueleto, que são susceptíveis de ocorrer quando as células separar 14-16. Para validar o uso da técnica de micro-aspiração para-substrato anexado células, testou-se a mostra de ruptura de F-actina resulta na diminuição da rigidez celular de células endoteliais aórticas bovinas (BAECs), estimados por esta abordagem. Figura 3 que, tal como esperado , este é realmente o caso. Especificamente, a Figura 3A mostra uma série de imagens fluorescentes típicas de uma membrana endotelial sofrer deformação progressiva em resposta à pressão negativa aplicada por meio de uma micropipeta. Como esperado, a membrana é gradualmente aspirada para a pipeta e o aspirated comprimento aumenta como uma função da pressão aplicada. Os cursos de tempo da mostra deformação que a ruptura de F-actina aumenta significativamente os comprimentos aspirados das projecções em todas as condições de pressão (Figura 3B) 14. Utilizando esta abordagem, descobrimos que a rigidez das células aumenta quando as membranas celulares são esgotadas de colesterol enquanto que o enriquecimento de colesterol não teve nenhum efeito 14. A Figura 4 mostra uma célula de colesterol-enriquecida, uma célula de controlo, e uma célula de colesterol-esgotada depois de atingir comprimentos de aspiração máximas nas -15 mm Hg (4A). As projeções normalmente começou a se desenvolver em-10mmHg eo tempo-cursos de deformação da membrana pode ser medido para as pressões negativas de -10, -15 e -20 milímetros Hg (4B). Aplicação de pressões acima de-25mmHg resultou na separação da projecção aspirado formando uma vesícula separado. O nível de pressão, que resultou na separação de membrana foi Similar, em diferentes condições de colesterol. Esta observação foi altamente inesperado porque estudos anteriores mostraram que em bicamadas lipídicas das membranas um aumento no colesterol da membrana aumenta a rigidez da membrana 5,17. Nossos estudos posteriores confirmaram essas observações usando várias abordagens independentes, incluindo Microscopia de Força Atômica e Microscopia 18,19 Tração Força 20. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig1.jpg" /> Figura 1. Vista lateral esquemática de uma pipeta de gravação. A pipeta é puxado para gerar uma haste cilíndrica na extremidade (vista de lado). Parâmetros micropipeta: D = 2a = diâmetro interno e ED = 2b = diâmetro externo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig2.jpg" /> Figura 2. Micropipeta aproximando de uma célula-substrato anexo (A) vista lateral esquemática;. (B) imagem de contraste brilhante de uma micropipeta shank tocar uma célula geralmente em forma usada em experimentos de aspiração, (C) imagem fluorescente de uma mesma célula marcada com DIIC 18. A micropipeta ainda é presente, mas é invisível (de 14). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig3.jpg" /> Figura 3. Validação de medir a rigidez das células no substrato de células usando-inscritos microaspiração. A: Imagens de deformação progressiva da membrana BAECs sob condições de controlo e após a exposição à latrunculin A pipeta é invisível nas imagens porque não apresentam fluorescência.. As células foram expostas a 2 uM latrunculin A durante 10 min, o que reduziu drasticamente a quantidade de F-actina, conforme medido por rodamina-faloidina fluorescência (não mostrado), mas não teve nenhum efeito significativo sobre a forma da célula. Em uma célula latrunculin-tratado, há uma diminuição da espessura da membrana no centro da projecção aspirado mas a saliência está ainda ligado ao cells. B. Um efeito de latrunculin sobre os cursos de tempo da deformação da membrana, em que L é aspirado comprimento da projecção da membrana e D é o diâmetro da pipeta para as células de controlo (n = 14) e as células expostas a 2 uM latrunculin A durante 10 min (n = 5). As células foram aspiradas com -10 mm Hg (diamantes), mm Hg -15 (quadrados) e mm Hg -20 (triângulos). (A partir de 14.) <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig4.jpg" /> Figura 4. Efeito dos níveis de colesterol na deformação da membrana celular de BAECs. A. Imagens típicas de deformação da membrana de colesterol-enriquecida, colesterol-empobrecido e células de controlo (as células de controlo foram expostos a MβCD: MβCD-colesterol mistura na proporção de 1:1, que não teve nenhum efeito sobre o nível de colesterol livre nas células (ver inset). As imagens apresentadas mostram a deformação máxima à temperatura de -15 mm Hg. A seta indica a posição da saliência aspirado. O bar é de 30 um. B. Tempo médio de cursos de comprimentos aspirados para as três populações de células experimentais. C. Comprimentos máximos aspirados traçado como uma função da pressão aplicada. O comprimento máximo normalizado em células exauridas foi significativamente mais baixa do que a de células de controlo de pressões de -15 mm Hg e mm Hg -20 (P &lt;0,05). (A partir de 14.)

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C., Agah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cancer+progression+on+the+viscoelasticity+of+ovarian+cell+cytoskeleton+structures.">The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , (2011).</li><li>Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+kinase+regulates+the+intracellular+micromechanical+response+of+adherent+cells+to+rho+activation.">Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+Actin+Cytoskeleton.">Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton.</a> Science. 279, 509-514 (1998).</li><li>Okajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+for+the+Examination+of+Single+Cell+Rheology.+In.">Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In.</a> Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).</li><li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+across+the+cell+surface+and+through+the+cytoskeleton.">Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li><li>Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+the+microrheology+of+living+cells.">Scaling the microrheology of living cells.</a> Physical Review Letters. 87, 148102 (2001).</li><li>Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+cytoskeletal+prestress.">Mapping the cytoskeletal prestress.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>Shin, D., Athanasiou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoindentation+for+obtaining+cell+biomechanical+properties.">Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties.</a> J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).</li><li>Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+fluids:+probing+mechanical+properties+of+biological+systems+with+optical+tweezers.">Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).</li><li>Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+membrane+tethers+revisited+using+magnetic+tweezers.">Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers.</a> Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Microaspiração proporciona um método simples e altamente reprodutível para estimar a rigidez das células / deformabilidade por aplicação de pressão negativa a uma membrana celular e de medição da deformabilidade da membrana em resposta à pressão bem definida. Ele foi desenvolvido por Mitchison e Swann (1954) para caracterizar as propriedades elásticas do mar, ouriços-do-ovos para fornecer insights sobre os mecanismos de divisão celular 21 e depois de olhar para as propriedades mecânicas em cé...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Número modelo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Sutter pipeta extrator </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Microforge </td><td> Narishige </td><td> MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio Fluorescente invertido </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert 200M </td><td> O microscópio deve ser de preferência equipado com capacidades 3D/deconvolution. </td></tr><tr><td> Videocamera </td><td> Zeiss </td><td> AxioCam MRM </td><td></td></tr><tr><td> Aquisição de Imagem sotware </td><td> Zeiss </td><td> AxioVision </td><td></td></tr><tr><td> Transdutor de Pressão Pneumático </td><td> BioTek </td><td> DPM-1B </td><td> DPM1B Tester transdutor pneumático agora pode ser encontrado por acaso. </td></tr><tr><td> Pipeta de vidro </td&gt; <td> Richland </td><td> Vidro personalizado </td><td> Pipetas foram personalizadas com um diâmetro de 1,2 e 1,6 de diâmetro interior exterior. </td></tr><tr><td> DiI Dye </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> Dissolve-se bem em DMSO </td></tr></tbody></table>

micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness

Número crescente de estudos mostram que as propriedades biomecânicas de células individuais desempenham um papel importante em várias funções celulares, incluindo proliferação, diferenciação, migração e interações célula-célula. Os dois principais parâmetros de biomecânica celulares são deformabilidade celular ou a rigidez e a capacidade das células para se contrair e gerar força. Descrevemos aqui um método rápido e simples para estimar a rigidez das células pela medição do grau de deformação da membrana em resposta à pressão negativa aplicada por uma micropipeta de vidro à superfície da célula, uma técnica que é chamado de aspiração por micropipeta ou microaspiração. Microaspiração é realizada puxando um capilar de vidro para criar uma micropipeta com uma ponta muito pequena (2-50 um de diâmetro, dependendo do tamanho de uma célula ou de uma amostra de tecido), o qual é então ligado a um transdutor de pressão pneumática e levada para um próximo vizinhança de uma célula sob um microscópio. Quando oponta da pipeta toca uma célula, um passo de pressão negativa é aplicada à pipeta pelo transdutor de pressão pneumática gerando pressão bem definida sobre a membrana celular. Em resposta à pressão, a membrana é aspirada para a deformação da membrana da pipeta e progressivo ou &quot;membrana de projecção&quot; na pipeta é medido como uma função do tempo. O princípio básico desta abordagem experimental é que o grau de deformação da membrana em resposta a uma força mecânica definida é uma função da rigidez da membrana. A membrana é mais rígida, mais lenta a taxa de deformação da membrana e quanto menor for o estado estacionário técnica comprimento.O aspiração pode ser realizada em células isoladas, quer em suspensão e substrato-conectados, organelas grandes, e lipossomas. A análise é efectuada por comparação da deformação da membrana máxima conseguida sob uma dada pressão para diferentes populações de células ou de condições experimentais. Um &quot;coeficiente de rigidez&quot; é esestimada a locando o comprimento aspirado de deformação da membrana como função da pressão aplicada. Além disso, os dados podem ser ainda analisada para estimar o módulo de Young das células (E), o parâmetro mais comum para caracterizar a rigidez dos materiais. É importante notar que as membranas plasmáticas de células eucarióticas pode ser visto como um sistema bi-componente, onde bicamada lipídica da membrana está subjacente se o citoesqueleto da membrana sub-e que é o citoesqueleto, que constitui o andaime mecânico da membrana e domina a deformabilidade do envelope celular. Esta abordagem, portanto, permite sondar as propriedades biomecânicas do citoesqueleto sub-membrana.

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Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Aqui nós descrevemos um método rápido e simples para medir a rigidez da célula. O princípio geral da presente abordagem é a de medir a deformação da membrana em resposta ao bem definido de pressão negativa aplicada por meio de uma micropipeta para a superfície celular. Este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar as propriedades biomecânicas do substrato anexados células.

Aspiração micropipeta de Células-substrato anexados para Estimar Rigidez celular

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

micropipette-aspiration-substrate-attached-cells-to-estimate-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.8K visualizações.  University of Illinois. Aqui nós descrevemos um método rápido e simples para medir a rigidez da célula. O princípio geral da presente abordagem é a de medir a deformação da membrana em resposta ao bem definido de pressão negativa aplicada por meio de uma micropipeta para a superfície celular. Este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar as propriedades biomecânicas do substrato anexados células.

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Bioengenharia

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Simples Multiwell Rigidez Ensaio para o Estudo das respostas das células Rigidez dependentes base de poliacrilamida

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

Um método para estimar cepas Cortical de fêmur cadavérico durante fratura testes usando a correlação de imagem Digital

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Cultura de células-tronco pluripotentes humanas em polivinil álcool-Co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes condições Xeno-livre

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Medição da rigidez de substratos de Silicone macio para estudos de Mechanobiology, usando um microscópio de fluorescência Widefield

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...