Os autores agradecem a Giulio Cossu, Martina Ragazzi e todo o laboratório por uma discussão e apoio úteis, e Jeff Chamberlain por fornecer gentilmente vetor MyoD-ER. Todos os experimentos envolvendo animais vivos foram concluídos de acordo com todas as agências, regulamentos e diretrizes regulatórias e institucionais relevantes. O trabalho no laboratório de autores é apoiado pelo Uk Medical Research Council, European Community 7th Framework projects Optistem and Biodesign e o Italian Duchenne Parent Project.

1. Avaliação do Potencial miogênico e engrafado
<ol><li>
In vitro: Diferenciação induzida pelo MYOD<ol>
<li>Gerar uma linha celular estável de IDEMs transduzidos com o vetor lentiviral myoxifen-ER indutível de tamoxifen, titulando a multiplicidade de infecção (MOI; por exemplo, 1, 5 e 50) utilizando a coloração descrita em 1.1.9 (MyHC) como resultado da eficiência do procedimento.</li>
		<li>Cubra um prato de 3,5 cm com 1 ml de 1% de Matrigel e incubar por 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Lave a placa duas vezes com idem médios e semeados 1 x10 5 MyoD-ER transduzidos no prato de cultura tecidual de 3,5 cm e incubar a 37 °C em meio de crescimento.</li>
		<li>Espere que as células atinjam a confluência em um ou dois dias e, em seguida, adicionem 1 μM 4OH-tamoxifen no meio de crescimento(1ª dose).</li>
		<li>Após 24 horas, substitua o meio de crescimento por meio de diferenciação complementado com 1 μM 4OH-tamoxifen (2ª e última dose).</li>
		<li>Substitua metade do meio por um novo meio de diferenciação a cada dois dias.</li>
		<li>Examine diariamente as culturas para a formação do miotube.</li>
		<li>Após uma semana (5 dias em meio de diferenciação), lave as placas suavemente com PBS e fixe com 4 % de paraformaldeído por 5 min no RT.</li>
		<li>Realize uma mancha de imunofluorescência com anticorpos contra a cadeia pesada de minocina (MyHC) para confirmar a presença de moxutadores. Contra-mancha com um corante nuclear (por exemplo, Hoechst).</li>
	</ol>
</li>
</ol>A eficiência da diferenciação é avaliada como o percentual de núcleos dentro das células myhc-positivas: proceda para o próximo passo se a eficiência for >50%.
<ol start="2"><li>
In vivo: engraftment em um modelo de regeneração muscular aguda Para avaliar a contribuição in vivo dos IDEMs MyoD-ER para a regeneração muscular, as células são previamente rotuladas com uma codificação vetorial para a proteína fluorescente verde (GFP) que permitirá rastreá-las dentro do tecido. Os IDEMs myoD-ER GFP são então injetados em músculos murinos adultos, anteriormente feridos com uma miotoxina (por exemplo, cardiotoxina). Para evitar a rejeição imune contra células xenogênicas (como HIDEMs) ou geneticamente manipuladas/corrigidas, é necessário usar camundongos imunodeficientes ou imunossupressores.<ol>
<li>Pré-trate os animais com uma injeção intra-peritoneal de 3,5 μl/g de 10 mg/ml tamoxifen (forma liposolúvel) 24 horas antes do transplante e células pré-tratamento adicionando 1 μM 4OH-tamoxifen (forma aquosa) no meio de crescimento durante a noite antes do dia do transplante.</li>
		<li>Administre anestesia e analgesia ao camundongo seguindo as diretrizes específicas que regulam procedimentos cirúrgicos na instalação animal.</li>
		<li>Injetar 25 μl de cardiotoxina de 100 μM (CTX; de Naja mossambica mossambica; ATENÇÃO: substância potencialmente prejudicial) nos músculos tibialis anteriores (TA).</li>
		<li>24 horas após o tratamento dos animais com tamoxifen e CTX, desprendem as células por experimentação e contagem.</li>
		<li>Centrifugar as células a 232 x g por 5 min.</li>
		<li>Lave a pelota celular em PBS Ca2+- e Mg2+livre, centrífuga e, em seguida, reapridar suavemente a pelota celular em Ca2+- e MG2+- PBS livre para uma concentração final de 106 células/30 μl, que será o volume final de cada injeção.</li>
		<li>Injete 30 μl de suspensão celular nos músculos anteriormente feridos usando uma seringa com agulha de 29 ou 30 G. Preste atenção especial ao remover a agulha do músculo. Faça-o lentamente, evitando derramar a suspensão da célula através da pista da agulha. Não transplante o TA contralateral e use-o como controle, injetando 30 μl de Ca2+- e   MG2+-PBS livre para replicar as condições do transplantado.</li>
		<li>Trate os animais com tamoxifeno por mais seis dias e administre analgesia (por exemplo, Carprofen) por mais dois dias.</li>
		<li>Explane os músculos a partir de 14 dias após o transplante em diante. Processe e analise as amostras conforme detalhado nos Protocolos 4 e 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Transplante em Modelos de Camundongos de Distrofia Muscular
Este ensaio de transplante permite avaliar a extensão do enxerto de IDEMs em modelos de camundongos de distrofia muscular. Os animais, tratados da seguinte forma, também podem ser avaliados para amenização funcional do fenótipo da doença. Os testes funcionais podem ser realizados a partir de duas semanas após o transplante. A fim de melhorar o enxerto considere realizar exercícios de esteira de pré-transplantação (como descrito no Protocolo 3) e/ou injeções de células seriais a cada três semanas para 3x (ou seja, para um total de 3 injeções/músculo).
<ol><li>Transplante intramuscular<ol>
<li>Pré-trate os animais com injeção intra-peritoneal de 3,5 μl/g de 10 mg/ml tamoxifen (formulação liposolúvel) 24 horas antes do transplante e células pré-tratamento adicionando 1 μM 4OH-tamoxifen (formulação aquosa) no meio de crescimento durante a noite antes do dia do transplante.</li>
		<li>Despeça por trippsinização, conte e centrifuge as células a 232 x g por 5 min.</li>
		<li>Lave a pelota celular em PBS Ca2+- e Mg2+- livre, centrífuga e, em seguida, resuspenda a pelota em Ca2+- e MG2+-livre PBS para uma concentração de 106 células/30 μl.</li>
		<li>Administre analgesia e desinfete a pele do animal (opcional) com um desinfetante à base de iodo ou clorexidina povidone. Isso também ajudará a localização dos músculos tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GC) e quadríceps femoris (QC; especificamente os músculos vastos intermedius).</li>
		<li>Injete 30 μl de suspensão celular nos músculos usando uma seringa com agulha de 29 ou 30 G. Para o TA, insira 5 mm da agulha 2 mm abaixo da inserção do tendão proximal (direção craniocaudal) com uma inclinação de 15° em relação à tíbia e injete lentamente a suspensão celular enquanto retrai a agulha (esvazie a seringa com 2 mm da agulha ainda dentro do músculo). Para o GC e QC, repita o mesmo procedimento detalhado para o TA, sendo a principal diferença a inserção caudocranista da agulha 2 mm acima da junção miotendinous do tendão de Aquiles para o tendão de Aquiles e 2 mm acima do tendão distal para o QC (inclinação de 15° em relação ao fêmur). Preste atenção ao remover a agulha do músculo, a fim de evitar derramar a suspensão celular através da pista da agulha. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: Em caso de baixo enenxerto considere injetar camundongos juvenis (1-2 semanas de idade)com 3 x 105 células/10 μl (note que neste caso o tamoxifeno precisa ser administrado subcutâneamente).</li>
	</ol></li>
	<li>Transplante intra-arterial Esta parte do protocolo permite que a avaliação da capacidade de MIDEMs e HIDEMs sejam entregues na circulação arterial, cruzem a parede do vaso e contribuam para a regeneração muscular esquelética nos músculos a jusante até o local da injeção.<ol>
<li>Pré-tratamento de animais e células como descrito acima na etapa 2.1.1.</li>
		<li>Despeça-se por trippsinização e filtro com um coador de células de 40 μm (para remover clusters da suspensão celular no caso improvável de que a exposição noturna ao tamoxifen possa impulsionar a fusão e a formação de miotubes a partir de células adjacentes) contar e centrifugar as células a 232 x g por 5 minutos</li>
		<li>Lave a pelota celular em PBS Ca2+- e Mg2+sem livre, centrífuga e, em seguida, resuspenda a pelota em Ca2+- e Mg2+-free PBS com 0.2 International Unidades de heparina de sódio (opcional) a uma concentração celular final de 106 células/50 μl. Adicione 10% Corante azul patente (concentração final: 1,25 mg/ml em soro fisiológico normal ou Ca2+- e MG2+-livre PBS) à solução a fim de visualizar a distribuição da suspensão celular.</li>
		<li>Administre anestesia e analgesia ao camundongo de acordo com as diretrizes que regulam procedimentos cirúrgicos na instalação específica de animais institucionais.</li>
		<li>Raspe a região inguinal (também conhecida como triângulo femoral ou de Scarpa) e desinfete a pele com um desinfetante à base de iodo ou clorexidina povidone.</li>
		<li>Faça uma incisão de 5-7 mm e localize o feixe femoral: veia, artéria e nervo (o nervo coloca lateralmente na artéria e na veia medial).</li>
		<li>Remova suavemente a fáscia conectiva que cobre o feixe com fórceps.</li>
		<li>Separe a veia femoral e o nervo da artéria introduzindo suavemente a ponta de um fórceps (ou uma agulha de 30 G) entre eles e aumentando progressivamente o orifício. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: A veia femoral é frágil: preste atenção para não beliscá-la com os fórceps durante seu desprendimento da artéria femoral. Em caso de hemorragia, drene o sangue com gaze estéril e use um micro cauterizador para facilitar a hemostasia.</li>
		<li>Levante a artéria com uma ponta dos fórceps e aperte a artéria com a outra ponta.</li>
		<li>Fure a artéria com uma seringa equipada com uma agulha de 30 G. Injete 50 μl de suspensão celular a jusante da área fixada, a uma velocidade de infusão de aproximadamente 5 μl/seg. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: Ressuspenque cuidadosamente as células na seringa antes da injeção: é vital evitar a precipitação de células e a formação de bolhas de ar dentro da seringa. O diâmetro da artéria femoral é ligeiramente menor do que uma agulha de 30 G: tenha cuidado para não truncar a artéria ao inserir a agulha. O corante azul patente permite reconhecer a eficácia da injeção: se corretamente injetado, todo o membro rapidamente ficará azul claro.</li>
		<li>Remova lentamente a agulha e as fórceps da artéria para restaurar a corrente sanguínea no membro.</li>
		<li>Aplique pressão com gaze estéril para evitar sangramento e/ou cauterização conforme necessário.</li>
		<li>Sutura a ferida e monitore os animais até a recuperação da anestesia.</li>
		<li>Administre a analgesia por 3 dias e inspecione a ferida diariamente (em caso de infecção por feridas, discuta isso com o pessoal da instalação animal e administre antibióticos conforme necessário).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Medidas de Resultado em Animais Distróficos Transplantados: Teste de esteira
A partir de duas semanas após o transplante celular, é possível avaliar a amenização funcional da capacidade motora dos camundongos tratados com os testes da esteira. Este teste permite a avaliação da tolerância ao exercício/resistência dos camundongos tratados. Um rato é considerado cansado quando se deita na área de descanso por mais de 5 segundos, sem tentar reengajar a esteira após uma série de 3 estímulos mecânicos consecutivos (um a cada 5 segundos). As medidas da linha de base começam aproximadamente um mês antes do tratamento e são usadas para avaliar a melhoria de cada animal testado. Este teste pode ser seguido por ensaios adicionais para monitorar a fragilidade das fibras, melhora da força, engrafia, diferenciação de células transplantadas e amelieração morfológica dos músculos transplantados (ver Discussão).
<ol><li>Aclimatar os animais (geralmente três grupos: tratados, não tratados e controles tipo silvestre/não distrófico) ao exercício antes da primeira medição: coloque a esteira a uma velocidade de 6 m/min por 10 minutos. Repita o procedimento dia não por uma semana. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: Registo todas as medições na mesma hora do dia para evitar vieses devido aos ciclos circadianos.</li>
	<li>Coloque os animais na esteira, que já foi montada anteriormente com uma inclinação de 10°.</li>
	<li>Ligue a esteira, com uma velocidade inicial de 6 m/min (forneça um estímulo mecânico suave no caso de os animais não estiverem dispostos a iniciar o exercício).</li>
	<li>Inicie o temporizador e aumente a velocidade em 2 m/min a cada 2 minutos.</li>
	<li>Assim que um animal fica na área de descanso por mais de 5 segundos sem tentar reengajar a esteira, toque-a suavemente com uma vara para estimular o reinício do exercício (veja acima).</li>
	<li>Regisso desempenho (tempo e ou distância) de cada animal.</li>
	<li>Repita as medições semanalmente ou a cada 10 dias por pelo menos 3x.</li>
	<li>Repita o mesmo procedimento após o transplante.</li>
	<li>Analise os dados de desempenho comparando a medição de cada animal com o desempenho da linha de base. Sugerimos traçar os valores em um gráfico como uma porcentagem da capacidade média do motor em relação à linha de base e analisá-los por um teste ANOVA de uma ou duas vias seguido de pós-teste apropriado para comparar os grupos.</li>
</ol>SOLUÇÃO DE PROBLEMAS: use um mínimo de 5 animais/grupo com correspondência de idade, genótipo e sexo e repita as medidas por pelo menos 3x após o transplante.
4. Avaliação do Engrafamento celular e diferenciação em músculos transplantados
Os músculos transplantados e de controle são colhidos no momento apropriado (<2 dias para análise de engraftment de curto prazo, 2-3 semanas para médio prazo e > 1 mês para análise de longo prazo). Se as células transplantadas forem rotuladas com GFP, o enxerto em músculos recém-isolados pode ser avaliado por fluorescência direta sob um estereóscópio equipado com UV.
<ol><li>Coloque e oriente ao longo do eixo vertical músculos recém-isolados na goma de tragachanth (6% c/v)</li>
	<li>Desidrate as amostras em isopentane pré-ciclimada por um minuto, congele-as em nitrogênio líquido por pelo menos 2 minutos e coloque-as imediatamente a -80 °C para armazenamento.</li>
	<li>Processe as amostras com um criostat para obter seções de 7 μm de espessura em slides polarizados. Prove a maioria dos músculos nos slides, coletando aproximadamente 8-10 slides com 30-40 seções/slide. É aconselhável coletar uma série de seções em um tubo de 1,5 ml para realizar ensaios de biologia molecular/bioquímica.</li>
	<li>Avalie o enxerto celular com diferentes manchas imunofluorescentes, dependendo da configuração experimental. Por exemplo, no caso do transplante HIDEM em camundongos Sgca-null/scid/bg, manchas com: a) um anticorpo contra Lamin A/C para detectar núcleos de células humanas enxertados; b) um anticorpo contra laminina para visualizar a estrutura geral do músculo; e c) um anticorpo contra Sgca para detectar a restauração derivada do doador da proteína ausente no animal distrófico.</li>
	<li>Quantifique, usando um microscópio de fluorescência, o número de núcleos doadores por seção muscular dentro e fora das fibras musculares e o número de miofibers esqueléticos derivados de doadores por seção.</li>
</ol>5. Histopatologia Muscular
Análises histopatológicas permitem a avaliação da estrutura morfológica do músculo transplantado. A melhoria arquitetônica na estrutura tecidual é esperada como resultado da abordagem da terapia celular.
<ol><li>Fixar os músculos recém-isolados com 4% de paraformaldeído por 1 hora a 4 °C.</li>
	<li>Desidratar as amostras com um gradiente ascendente de sacarose (por exemplo, 7,5-15-30% c/v).</li>
	<li>Deixe os músculos durante a noite na solução de sacarose mais alta.</li>
	<li>Incorpore as amostras em Tissue Tek OCT, coloque-as em isopentane pré-cichilled até que o OCT se torne sólido (evitando a imersão completa das amostras), congele-as em nitrogênio líquido por pelo menos 2 minutos e coloque-as imediatamente a -80 °C para armazenamento.</li>
	<li>Processe as amostras com um criostat para obter seções de 7 μm de espessura conforme descrito acima.</li>
	<li>Manche as seções com hematoxilina e eosina ou tricromome de Masson de acordo com os protocolos do fabricante padrão.</li>
</ol>A hematoxilina e a coloração de eosina permitem calcular marcas do músculo regenerador, tais como: a) o número de miofibers; b) área transversal; c) o número de miofibers contendo um núcleo central. O tricromome de Masson é usado para calcular o índice fibroso, feito subtraindo a área total ocupada pelos miofibers esqueléticos da área total da imagem: a área resultante reflete principalmente o infiltrado conjuntivo e gordo do músculo. Todas as análises nas imagens poderiam ser realizadas usando o software ImageJ (NIH) com a ferramenta de medição e o plugin do contador de células.

<ol>
	<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells.">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).</li><li>Minasi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meso-angioblast:+a+multipotent,+self-renewing+cell+that+originates+from+the+dorsal+aorta+and+differentiates+into+most+mesodermal+tissues.">The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues.</a> Development. 129, 2773-2783 (2002).</li><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells.">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat. Commun. 2, 499 (2011).</li><li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+skeletal+muscle:+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).</li><li>Sampaolesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+of+alpha-sarcoglycan+null+dystrophic+mice+through+intra-arterial+delivery+of+mesoangioblasts.">Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts.</a> Science. 301, 487-492 (2003).</li><li>Sampaolesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoangioblast+stem+cells+ameliorate+muscle+function+in+dystrophic+dogs.">Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs.</a> Nature. 444, 574-579 (2006).</li><li>Tedesco, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Genetically+Corrected+Human+iPSC-Derived+Progenitors+in+Mice+with+Limb-Girdle+Muscular+Dystrophy.">Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Tedesco, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-mediated+transfer+of+a+human+artificial+chromosome+ameliorates+muscular+dystrophy.">Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy.</a> Sci. Transl. Med. 3, (2011).</li><li>Lattanzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+myogenic+conversion+of+human+fibroblasts+by+adenoviral+vector-mediated+MyoD+gene+transfer.+An+alternative+strategy+for+ex+vivo+gene+therapy+of+primary+myopathies.">High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies.</a> J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).</li><li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies:+validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+Duchenne+muscular+dystrophy+cells.">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells.</a> Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).</li><li>Kimura, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-lineage+regulated+myogenesis+for+dystrophin+replacement:+a+novel+therapeutic+approach+for+treatment+of+muscular+dystrophy.">Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+past,+present,+and+future.">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li><li>Wu, S. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+potential+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+regenerative+medicine.">Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine.</a> Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).</li></ol>

F.S.T. registrou um pedido de patente internacional (não. PCT/GB2013/050112) incluindo parte da estratégia descrita neste artigo. Ele recebeu financiamento da Promimetic e DWC Ltd. para sua pesquisa.

Os iPSCs podem ser expandidos indefinidamente, preservando seu potencial de auto-renovação e, portanto, orientados a diferenciar-se em uma ampla gama de linhagenscelulares 12. Por essa e outras razões, as células-tronco/progenitoras derivadas do iPSC são consideradas uma fonte promissora para abordagens autólogas de genética e terapia celular13. Um trabalho publicado anteriormente pelos Autores relatou a geração de progenitores miogênicos e camundongos humanos de iPSCs com um fenótipo sem...

Mesoangioblasts (MABs) são progenitores musculares associados ao vaso derivados de um subconjunto de pericílitos1-3. A principal vantagem dos MABs sobre progenitores musculares canônicos, como as células satélites4, reside em sua capacidade de atravessar a parede do vaso quando entregue intra-arterial e, portanto, contribuir para a regeneração muscular esquelética nos protocolos de terapia celular. Este recurso foi avaliado e confirmado em modelos murinos e caninos de distrofia muscular1,5,6. Esses estudos pré-clínicos construíram as bases para um primeiro ensaio clínico de fase I/II baseado no transplante intra-arterial de MABs idênticos ao doador HLA em crianças com distrofia muscular de Duchenne (EudraCT nº 2011-000176-33; atualmente em andamento no Hospital San Raffaele de Milão, Itália). Um dos principais obstáculos das abordagens terapêuticas celulares, onde bilhões de células são necessárias para tratar o músculo de todo um corpo, é o limitado potencial proliferativo do "medicamento" (as células). Além disso, foi recentemente demonstrado que não é possível obter MABs de pacientes afetados por algumas formas de distrofias musculares, pois ocorre na distrofia muscular de cinta de membros 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
Para superar essas limitações, foi recentementeestabelecidoum protocolo para a deriva de células-tronco/progenitoras semelhantes ao MAB de iPSCs humanos e murinos. Este procedimento gera populações celulares facilmente expansíveis com uma assinatura genética vascular e imunofenótipo altamente semelhante aos MABs derivados de músculos adultos. Após a expressão do fator regulatório miogênico MyoD, tanto os IDEMs murinos quanto humanos (respectivamente MIDEMs e HIDEMs) passam por diferenciação muscular esquelética terminal. Para atingir esse objetivo, os IDEMs podem ser transduzidos com vetores capazes de conduzir a expressão MyoD, seja constitutivamente ou de forma indutível8-10. É utilizado um vetor lentiviral contendo myoD cDNA fundido com o receptor de estrogênio (MyoD-ER), permitindo assim sua translocação nuclear sobre a administração de tamoxifen (análogo de estrogênio)11. Essa estratégia resulta na formação de miótubos multinucleados hipertróficos, com alta eficiência7. Notavelmente, os IDEMs não sãotumorgênicos, podem engrafar e diferenciar os músculos hospedeiros no momento do transplante e podem ser geneticamente corrigidos usando diferentes vetores (por exemplo, lentivírus ou cromossomos artificiais humanos), abrindo caminho para futuras estratégias terapêuticas autólogas. A derivação, caracterização e transplante de IDEMs foram descritas na publicação acima7. Este documento protocolar detalha os ensaios realizados para avaliar a diferenciação miogênica in vitro dos IDEMs e as medidas subsequentes de desfecho para testar a eficácia de seu transplante em modelos de regeneração muscular.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MegaCell DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0090L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Calcium/Magnesium free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutammine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilline/Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (Insulin-Transferrin-Selenium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fer-In-Sol</td>
			<td>Mead Johnson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferlixit</td>
			<td>Aventis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01257-10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5900-10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human bFGF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>AA 10-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grow factors-reduced Matrigel</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium heparin</td>
			<td>Mayne Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patent blue dye</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>19, 821-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>P001</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OH Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLv-CMV-MyoD-ER(T)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiotoxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9759</td>
			<td>HARMFUL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragachant gum</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>104792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopenthane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24,872,323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27,480,294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarized glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HHS32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s trichrome</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>04-010802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti Lamin A/C antibody</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NLC-LAM-A/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4/11/13</td>
			<td>Cappel</td>
			<td>559762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma fluka</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Laminin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MATERIALS AND EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adsorbable antibacteric suture 4-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>vcp310h</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treadmill</td>
			<td>Columbus instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steromicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane unit</td>
			<td>Harvad Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optics</td>
			<td>Euromecs (Holland)</td>
			<td>EK1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>C17A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>11REF050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td></td>
			<td>5/45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High temperature cauteriser</td>
			<td>Bovie Medical</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MEDIA COMPOSITION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Media composition is detailed below. 
			HIDEMs growth medium:
			<ul>
				<li>MegaCell Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM)</li>
				<li>5% fetal bovine serum (FBS)</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</li>
				<li>1% non essential amino acids</li>
				<li>5 ng / ml human basic fibroblast growth factor (bFGF)</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
			</ul>
			Alternatively, if some of the above reagents are not available, HIDEMs can be grown in:
			<ul>
				<li>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</li>
				<li>10 % FBS</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</li>
				<li>1% Non essential amino acids (NEAA)</li>
				<li>1% ITS (insulin / transferrin / selenium)</li>
				<li>5 ng / ml human bFGF</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
				<li>0.5 &#956;M oleic and linoleic acids</li>
				<li>1.5 &#956;M Fe2+ (Fer-In-Sol)</li>
				<li>0.12 &#956;M Fe3+ (Ferlixit)</li>
			</ul>
			MIDEMs growth medium:
			<ul>
				<li>DMEM</li>
				<li>20 % FBS</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
				<li>5 ng / ml human bFGF</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
			</ul>
			Differentiation medium:
			<ul>
				<li>DMEM</li>
				<li>2 % Horse Serum (HS)</li>
				<li>100 IU ml penicillin</li>
				<li>100 mg / ml streptomycin</li>
				<li>2 mM glutamine</li>
			</ul>
			 
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.

transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration

IPSCs derivados do paciente podem ser uma fonte inestimável de células para futuros protocolos de terapia celular autóloga. Células progenitoras miogênicas/progenitoras derivadas do iPSC semelhantes aos mesoangioblasts derivados de pericílito (células-tronco/progenitoras derivadas do iPSC: IDEMs) podem ser estabelecidas a partir de iPSCs gerados a partir de pacientes afetados por diferentes formas de distrofia muscular. Os IDEMs específicos do paciente podem ser geneticamente corrigidos com diferentes estratégias (por exemplo, vetores lentivirais, cromossomos artificiais humanos) e aprimorados em seu potencial de diferenciação miogênica após a superexpressão do myogenesis regulator MyoD. Esse potencial miogênico é então avaliado in vitro com ensaios de diferenciação específicos e analisado por imunofluorescência. O potencial regenerativo dos IDEMs é ainda avaliado in vivo, notransplante intramuscular e intra-arterial em dois modelos representativos de camundongos que apresentam regeneração muscular aguda e crônica. A contribuição dos IDEMs para o músculo esquelético hospedeiro é então confirmada por diferentes testes funcionais em camundongos transplantados. Em particular, a amenização da capacidade motora dos animais é estudada com testes de esteira. O engrafamento celular e a diferenciação são então avaliados por uma série de ensaios histológicos e imunofluorescência em músculos transplantados. No geral, este artigo descreve os ensaios e ferramentas atualmente utilizados para avaliar a capacidade de diferenciação dos IDEMs, com foco nos métodos de transplante e medidas de desfecho subsequentes para analisar a eficácia do transplante celular.

Os resultados representativos relatados seguem os principais ensaios in vitro/in vivo retratados no fluxo de trabalho na Figura 1. 48 horas após 4OH-tamoxifen administração Núcleos myoD-positivos são identificáveis dentro de IDEMs transduzidos myoD-ER na cultura(Figura 2A). As células então se fundem e se diferenciam em miótubos multinucleados(Figura 2B). Quando transplantados intramuscularmente em um modelo murino de lesão muscular aguda, os IDEMs con...

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration at JoVE.com

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Progenitores miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são candidatos promissores para estratégias de terapia celular para tratar distrofias musculares. Este protocolo descreve transplantes e medidas funcionais necessárias para avaliar o enenxerto e diferenciação dos mesoangioblastos derivados do iPSC (um tipo de progenitores musculares) em modelos de camundongos de regeneração muscular aguda e crônica.

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

transplantation-induced-pluripotent-stem-cell-derived-mesoangioblast

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K visualizações.  University College London. Progenitores miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são candidatos promissores para estratégias de terapia celular para tratar distrofias musculares. Este protocolo descreve transplantes e medidas funcionais necessárias para avaliar o enenxerto e diferenciação dos mesoangioblastos derivados do iPSC (um tipo de progenitores musculares) em modelos de camundongos de regeneração muscular aguda e crônica.

Vídeo: Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Bioengenharia

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Padronização da geometria de colônias de células-tronco embrionárias humanas em substratos compatíveis para controlar a mecânica de nível de tecido

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney disease and eventual end-stage renal failure are often caused by the damage to the glomerular podocytes, which are the highly specialized epithelial cells that function together with endothelial cells and the glomerular basement membrane to form the kidney&#8217;s filtration barrier. Advances in renal medicine have been hindered by the limited availability of primary tissues and the lack of robust methods for the derivation of functional human kidney cells, such as podocytes. The ability to derive podocytes from renewable sources, such as stem cells, could help advance current understanding of the mechanisms of human kidney development and disease, as well as provide new tools for therapeutic discovery. The goal of this protocol was to develop a method to derive mature, post-mitotic podocytes from human induced pluripotent stem (hiPS) cells with high efficiency and specificity, and under chemically defined conditions. The hiPS cell-derived podocytes produced by this method express lineage-specific markers (including nephrin, podocin, and Wilm&#8217;s Tumor 1) and exhibit the specialized morphological characteristics (including primary and secondary foot processes) associated with mature and functional podocytes. Intriguingly, these specialized features are notably absent in the immortalized podocyte cell line widely used in the field, which suggests that the protocol described herein produces human kidney podocytes that have a developmentally more mature phenotype than the existing podocyte cell lines typically used to study human kidney biology.

Presented here is a chemically defined protocol for the derivation of human kidney podocytes from induced pluripotent stem cells with high efficiency (&#62;90%) and independent of genetic manipulations or subpopulation selection. This protocol produces the desired cell type within 26 days and could be useful for nephrotoxicity testing and disease modeling.

Diferenciação guiada de podocitos renais maduros de células-tronco pluripotentes induzidas humanas sob condições quimicamente definidas

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of functional models that can accurately predict human biological responses and nephrotoxicity. Advancements in kidney precision medicine could help overcome these limitations. However, previously established in vitro models of the human kidney glomerulus-the primary site for blood filtration and a key target of many diseases and drug toxicities-typically employ heterogeneous cell populations with limited functional characteristics and unmatched genetic backgrounds. These characteristics significantly limit their application for patient-specific disease modeling and therapeutic discovery. 
This paper presents a protocol that integrates human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived glomerular epithelium (podocytes) and vascular endothelium from a single patient to engineer an isogenic and vascularized microfluidic kidney glomerulus chip. The resulting glomerulus chip is comprised of stem cell-derived endothelial and epithelial cell layers that express lineage-specific markers, produce basement membrane proteins, and form a tissue-tissue interface resembling the kidney's glomerular filtration barrier. The engineered glomerulus chip selectively filters molecules and recapitulates drug-induced kidney injury. The ability to reconstitute the structure and function of the kidney glomerulus using isogenic cell types creates the opportunity to model kidney disease with patient specificity and advance the utility of organs-on-chips for kidney precision medicine and related applications.

Presented here is a protocol to engineer a personalized organ-on-a-chip system that recapitulates the structure and function of the kidney glomerular filtration barrier by integrating genetically matched epithelial and vascular endothelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. This bioengineered system can advance kidney precision medicine and related applications.

Chip de glomérulo renal isogênico projetado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used in regulatory submissions. Here, we extend their use to cardiac medical device safety or performance assessments. We developed a novel method to evaluate cardiac medical device contractile properties in robustly contracting 2D hiPSC-CMs monolayers plated on a flexible extracellular matrix (ECM)-based hydrogel substrate. This tool enables the quantification of the effects of cardiac electrophysiology device signals on human cardiac function (e.g., contractile properties) with standard laboratory equipment. The 2D hiPSC-CM monolayers were cultured for 2-4 days on a flexible hydrogel substrate in a 48-well format.
The hiPSC-CMs were exposed to standard cardiac contractility modulation (CCM) medical device electrical signals and compared to control (i.e., pacing only) hiPSC-CMs. The baseline contractile properties of the 2D hiPSC-CMs were quantified by video-based detection analysis based on pixel displacement. The CCM-stimulated 2D hiPSC-CMs plated on the flexible hydrogel substrate displayed significantly enhanced contractile properties relative to baseline (i.e., before CCM stimulation), including an increased peak contraction amplitude and accelerated contraction and relaxation kinetics. Furthermore, the utilization of the flexible hydrogel substrate enables the multiplexing of the video-based cardiac-excitation contraction coupling readouts (i.e., electrophysiology, calcium handling, and contraction) in healthy and diseased hiPSC-CMs. The accurate detection and quantification of the effects of cardiac electrophysiological signals on human cardiac contraction is vital for cardiac medical device development, optimization, and de-risking. This method enables the robust visualization and quantification of the contractile properties of the cardiac syncytium, which should be valuable for nonclinical cardiac medical device safety or effectiveness testing. This paper describes, in detail, the methodology to generate 2D hiPSC-CM hydrogel substrate monolayers.

Here, we demonstrate a non-invasive cardiac medical device contractility evaluation method using 2D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) monolayers, plated on a flexible substrate, coupled with video-based microscopy. This tool will be useful for the in vitro evaluation of the contractile properties of cardiac electrophysiology devices.

Avaliação da Terapia de Modulação da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Humanas 2D

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

Geração de Organoides de Vasos Sanguíneos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

Geração, Triagem de Alto Rendimento e Biobanco de Esferoides Cardíacos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos.

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...