Há muitas pessoas que contribuíram para este trabalho e são mais da membrana estrutural e Grupo de Biologia Funcional, ambos membros passados ​​e presentes. Para todos nós estendemos nossos mais sinceros agradecimentos e apreciação. Este trabalho foi financiado em parte por doações da Fundação Ciência da Irlanda (07/IN.1/B1836), os Institutos Nacionais de Saúde (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e do 7 CM0902 Acção COST.

1. Preparar a placa de Cristalização Definindo-se a fazer um teste de cristalização roboticamente começa com a preparação da placa de base da placa de cristalização de vidro sanduíche (Figura 2), descrita em detalhe em referência 2. A placa de base tem de ser previamente silanizada e o espaçador duplo-aderente perfurado que cria cavidades, tem de ser aplicada à placa. Os materiais e suprimentos necessários para isso são discriminados em Materiais. <ol><li> Colocar a placa numa toalha de papel, aplicam-se algumas gotas de solução de silanização e distribuí-lo uniformemente ao longo da superfície da placa com um lenço de papel. </li><li> Remover o excesso de solução de silanização por imersão da placa numa proveta de água. </li><li> Pegue a placa fora do copo, coloque-o em uma toalha de papel seca, silanizado lado, e secar a sua superfície exposta limpando suavemente com uma toalha de papel. </li><li> Retire a tampa de proteção no perfurada, espaçador dupla varae aplicar o espaçador lado, pegajoso para baixo, para a superfície, seca silanizada da placa de vidro. Certifique-se de que o espaçador é posicionado correctamente na placa de base, com o canto superior esquerdo e os dois lados adjacentes do espaçador e da placa, coincidentes. </li><li> Usar um rolo ou Brayer para achatar o espaçador na placa de base e para criar uma vedação estanque entre ambos. </li></ol> Pré-montadas placas estão disponíveis comercialmente (HR3-151, Hampton Research; MD11-55-100, dimensões moleculares, e LCP96T-UVP70U, Swissci). Por razões de custo, preferimos montar nossas próprias chapas seguindo o protocolo acima. 2. Na Meso Robô 1 O primeiro em meso robô para ser demonstrado neste artigo de vídeo é o actualmente em uso na MS e Grupo FB (Figura 3). Todos os detalhes sobre o robô pode ser encontrado em materiais e na seção de Referência 5. Os materiais e equipment necessário para configurar um processo de cristalização usando o robô são discriminados em Materiais. <ol><li> Colocar a placa de base com o espaçador preparado na Secção 1 sobre o convés do robô. Ele tem sua própria plataforma marcada com posições bem para fins de base de placa-alinhamento. A placa deve ser marcada para fins de identificação. </li><li> Fixar o bloco de 96 poços precipitante na sua própria plataforma sobre o convés do robô ao lado da placa de cristalização. </li><li> Abra o bloco de cuidado por descascar a tampa de vedação de plástico. </li><li> Ligue o humidificador e dirigir o fluxo de ar húmido e sobre toda a placa de base sobre o convés do robô. O humidificador tem sido mostrado para reduzir a evaporação da solução de agente precipitante e para melhorar a reprodutibilidade do outro lado da placa de cristalização 5. Ele pode ser ligado antes de configurar a pré-umidificar a área quando a umidade relativa do ar é baixa, ou de outra forma, um pouco antes da dispensação de mesofase começa. </li><li> Inicializar o robô seguindo as instruções do fabricante. Instruções específicas do instrumento não será descrito aqui em detalhe, porque os procedimentos exactos irão mudar ao longo do tempo. Essencialmente, o que acontece durante a inicialização que a mesofase dispensa braço do robô é fornecido com as posições de referência em três direcções ortogonais X, Y e Z. </li><li> Anexar a mesofase proteína-laden numa seringa Hamilton, completo com distribuição da agulha, para o Braço 1 do robô (Figura 3). Todos os detalhes de como preparar a mesofase e colocá-lo dentro da seringa ter sido descrito em referências 3,7-10. </li><li> Remover a tampa superior de protecção do espaçador na cristalização placa de base e alinhar as cavidades na placa com fiduciais sobre a plataforma de base da placa. Nota, para o propósito deste vídeo, a tampa de protecção foi deixado no local para auxiliar o visualizador durante a etapa de alinhamento. </li><li> Alinhar a ponta da agulha do distribuidor syringe com o fundo do poço superior, no canto esquerdo da placa de cristalização (Bem A1). Isto é feito através do olho ajustando a altura ou a coordenada Z do braço de distribuição, enquanto observa a proximidade da ponta da agulha chega ao fundo do poço. Que a ponta é apenas a tocar o fundo da cavidade pode ser julgada, movendo a placa de lado a lado na plataforma ao mesmo tempo muito ligeiramente de ajustar a altura do braço de distribuição. </li><li> Entre no computador da coordenada Z do braço distribuição onde os contatos ponta a placa. Dispensing está programado para ter lugar com a ponta da agulha 80 micrômetros de esta referência Z-posição que corresponde à superfície da placa de base. </li><li> Posição por olho a ponta da agulha no centro do poço A1. Armazenar em que o computador controla a referência X, Y coordenadas do braço de distribuição em que a ponta está centrado. Esta cota é usado para definir o centro das cavidades remanescentes sobre a placa. </li><li> Prime seringa utilizando o comando adequado no computador robô para garantir que mesofase fresco enche a agulha de distribuição, e que os primeiros poços e subsequente receber o seu complemento completo de mesofase. Limpe mesofase extrudido sobre a ponta da agulha com um tecido. </li><li> Inicie o programa Run Robot (X-AP) para iniciar uma rodada de rubor etapas onde as pontas precipitantes distribuição no braço 2 do robô são lavados e preparados para aspirar soluções a partir do bloco precipitante. </li><li> Activar o. Dispensar função do robô para colocar em movimento o carregamento sequencial de poços com proteína carregada de mesofase (normalmente 50 nl) em primeiro lugar, uma coluna de oito poços de uma vez, seguido de soluções de precipitantes (geralmente 800 nl) Entre as colunas de carga, os retornos mesofase braço de distribuição para uma posição de estacionamento, onde a ponta da agulha é colocada em uma esponja humedecida para impedir a mesofase na ponta de secar. O processo de dosagem e mesofase precipitante é repetido11 vezes ao longo da placa até que a placa seja preenchida. O carregamento de uma placa de 96 poços com mesofase e precipitante leva 5 minutos para completar. </li><li> Assim que a placa está cheio, e os braços de robô regressaram às suas posições de parque, remover a placa do convés do robô e colocá-lo sobre uma superfície plana e sólida. </li><li> Imediatamente, selar a placa com uma tampa de vidro para minimizar o tempo-dependentes de alterações na composição bem. É importante assegurar que todos os 96 poços estão completamente cobertos, que o vidro de cobertura está alinhada com a base quadrada de placa e que nenhum do vidro de cobertura estende-se para além da área de contacto da placa de base. Um rolo ou Brayer é usado para criar um selo apertado e uniforme entre a cobertura de vidro e o espaçador. </li><li> Inspecione a placa para garantir que o set-up foi como deveria. O que se está procurando é um &quot;ovo frito em uma panela&quot; aparência em cada poço. A gema do ovo frito corresponde ao mesofase. A clara de ovo é a soluti precipitanteem e a borda da panela é o perímetro da cristalização bem. Idealmente, os três são concêntricas. </li><li> Colocar a placa numa área de armazenamento de temperatura controlada para o crescimento de cristais. </li><li> Se não houver mais placas estão a criar, remover o bloco precipitante da plataforma do robô, feche-o bem e colocá-lo de volta para o armazenamento. </li><li> Remover a seringa que contém a mesofase do braço de distribuição do robô, desmontá-la, e lavar as peças, incluindo distribuição de agulhas e de virola, cuidadosamente com metanol e seco, em preparação para a próxima utilização. </li></ol> 3. Na Meso robô 2. Mosquito LCP O LCP Mosquito robô (Figura 4) inclui um distribuidor de mesofase semelhante ao utilizado pelo robô 1. Em contraste com um robô, dispensa precipitante, por meio de pontas descartáveis. Software de programação é usado para configurar o instrumento para trabalhar com placas de cristalização particulares e precipitblocos de formigas, e para dispensar volumes definidos pelo usuário de mesofase e precipitante em uma seqüência especificada. Tais detalhes são fornecidos pelo fabricante, e não será descrito aqui. <ol><li> Prepara-se uma seringa Hamilton, completo com a agulha e preenchido com proteína carregada de mesofase, como descrito acima sob Robot 1 e no artigo JoVE 1712 1. </li><li> Prender a seringa na posição sobre o braço de distribuição do robô. </li><li> Usar o convés montado sensor laser para estabelecer as coordenadas X e Y da agulha na seringa distribuidora. Este é um importante passo necessário para garantir que a mesofase é distribuído com precisão no centro de cada poço na placa. </li><li> Com o toque de um botão no painel de controle, primeiro a seringa para expulsar mesofase da agulha. Remover mesofase extrudido a partir da ponta da agulha com um tecido em preparação para a utilização do robô para carregar poços. </li><li> Antes de colocar a placa de cristalização no convés do robô húmidoen o da superfície da plataforma, com algumas gotas de água para ajudar a manter a placa no lugar por capilaridade. </li><li> Remova a tampa protetora do espaçador no vidro placa de base e colocá-lo em sua plataforma com firmeza para garantir uma boa aderência. Use as três fiduciais na plataforma para alinhar as três cavidades de canto desse modo assegurando o posicionamento adequado dos poços na placa em relação à ponta da agulha de distribuição. O instrumento é agora comandado para introduzir um ciclo de distribuição. </li><li> O ciclo começa com um passo de escorva segundo onde mesofase é dispensada numa placa de vidro pequeno imediatamente antes de passar para carregar cavidades com mesofase fresco. As cargas primeiro robô com mesofase uma coluna vertical de 8 poços na placa e, em seguida, utiliza as pontas descartáveis ​​para dispensar solução precipitante no topo do bolo de mesofase. O processo é repetido 11 vezes ao longo do comprimento da placa até que todos os poços são cheios. Todo o processo leva cerca de 5 minutos para completar. </li><li> Removera placa cheia a partir da plataforma do robô e selá-lo com uma tampa de vidro, tal como descrito acima sob o título do robô 1. </li><li> Colocar a placa, adequadamente rotulado, num ambiente de temperatura controlada para o crescimento de cristais. </li></ol> 4. Na Meso Robot 3. Gryphon LCP O LCP Gryphon robô (Figura 5) incorpora um sistema de distribuição de mesofase semelhante ao descrito acima para os robôs 1 e 2. O que o distingue dos outros dois é que todas as 96 soluções precipitantes são dispensados ​​simultaneamente. <ol><li> Preparar a mesofase proteína-laden e carregá-lo no interior da seringa de distribuição, tal como descrito acima, sob Robots 1 e 2, e no artigo JoVE 1712 1. </li><li> Prender a seringa na posição sobre o braço de distribuição do robô. </li><li> Coloque o bloco solução precipitante e prato de cristalização no convés do robô. </li><li> Coloque o hea 96-pontad com soluções precipitantes. Um utilizador definido tempo de atraso é fornecido para facilitar a aspiração de precipitantes viscosos. </li><li> Comandar o aparelho para introduzir um ciclo de distribuição. O ciclo inicia-se com a mesofase ser distribuído sequencialmente para os 96 poços em um processo que leva cerca de 1 min para completar. A cabeça 96 da ponta, em seguida, distribui-as 96 soluções precipitantes de uma só vez no topo dos bolus mesofase nos poços de cristalização. O processo de carregamento de toda a placa é terminado em 2 min. </li><li> Remova a placa cheia a partir da plataforma do robô e selá-lo com uma tampa de vidro, tal como descrito acima sob o título do robô 1. </li><li> Colocar a placa, adequadamente rotulado, num ambiente de temperatura controlada para o crescimento de cristais. </li></ol> 5. Resultados representativos O objetivo deste artigo é demonstrar de vídeo como configurar automaticamente ensaios de cristalização com um viscoso, mesofase membrana-proteína carregado de vidro sandwich placas de 96 poços de cristalização. A ênfase está na automação através do uso de robôs especializados que requerem intervenção manual mínima. Reprodutibilidade e precisão, em termos de volumes de mesofase e precipitante dispensado e a colocação de ambos dentro do poço, é esperado quando um robô é usado. Estes são importantes do ponto de vista de rastreio eficaz de condições que suportam crystallogenesis. Eles também são críticos para a etapa seguinte em que o oleoduto análise é o de avaliar o crescimento de cristais, muitas vezes feitas com equipamentos de imagem. Local de soltar ou bolus é a chave para o processo de imagem e posicionamento irregular e indevida de bolus no bem normalmente requer intervenção do usuário para corrigir e leva tempo. Para fins de ilustração, exemplos de chapas correcta e incorrectamente carregadas são mostradas na Figura 6. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig1.jpg" alt="Figura 1" /> <html> Figura 1. O fluxograma resume os passos envolvidos na produção de colheita, e crio-de arrefecimento em meso-crescidos cristais de proteína de membrana. Passos cercado pela linha vermelha são o foco deste artigo Jove. Robôs foram usados ​​para distribuir soluções mesofase e precipitante em Passos 29-32. Da referência 3. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4000/4000fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Uma totalmente carregado e selado de 96 poços da placa de vidro de cristalização sanduíche. Cada poço contém 50 nl fase cúbica e uma solução precipitante ul. Para maior clareza, a fase cúbica foi corado com Sudan Red e a solução precipitante compreende azul de metileno. A partir de Referência 5. _upload/4000/4000fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. No meso O robô (Robot 1). O robô tem duas armas. Braço uma dispensa a mesofase proteína-laden lipídica. Braço 2 distribui soluções precipitantes. Durante o enchimento, a placa de 96 poços permanece fixo em posição no convés do robô que em si é estacionária. Os dois braços se movem para oferecer soluções mesofase e precipitante. A partir de Referência 3. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Mosquito A LCP robô (Robot 2). Em contraste com o robô 1, o convés do LCP Mosquito, sobre a qual se sente a placa de 96 poços e o bloco solução precipitante, se move horizontalmente, durante o enchimento. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Gryphon A LCP robô (Robot 3). Durante umaconfigurado, o distribuidor de fase lipídica cúbico move-se para proporcionar a proteína carregada de mesofase para a placa de 96 poços. O deck então traduz na horizontal para posicionar a placa sob a cabeça precipitante solução ponta. Todas as 96 soluções precipitantes são dispensados ​​simultaneamente. Imagem obtida a partir do fabricante ( <a href="http://www.artrobbins.com/" target="_blank">http://www.artrobbins.com/</a> ) e etiquetadas. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Um totalmente carregado e selado de 96 poços da placa de sanduíche de vidro (A) e os poços adequadamente (B) e impropriamente (C, D) preenchido com o no meso robot (robô 1). A etiqueta de código de barras sobre a placa de A é utilizado para rastrear a placa na incubadora a placa de dispositivo / de imagem. Em painéis de solução de BD, precipitante e mesofase são marcados P e M, respectivamente. O esperado &#39;ovo frito em uma panela&#39;aparecimento do bem em B é característica de um correctamente colocado e selado bem. Em C, o precipitado foi distribuído para dentro do poço indevidamente numa posição fora de centro e entrou em contacto com o espaçador. Em C, afigura-se também que o volume de mesofase é menor do que deveria ser. Um exemplo de carga incompleta com solução precipitante é mostrado em D. Por escala, o diâmetro de cada um dos poços é de 6 mm.

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo de vídeo demonstramos como usar um robô para configurar automaticamente em ensaios de cristalização meso em placas de 96 poços de vidro sanduíche usando uma mesofase proteína-laden lipídica. Os robôs usados ​​neste trabalho foram especialmente concebidos de modo a incluir uma seringa de vidro de deslocamento positivo para o fornecimento preciso e reprodutível dos volumes nanolitros da mesofase viscosa e pegajosa, conforme descrito originalmente 7. Exatidão e precisão são características importantes de um robô. No entanto, essas características são apenas tão bom quanto o grau de e regularidade que o desempenho do robô é avaliado e calibração é realizada. Escusado será dizer que o desempenho do robô deve ser avaliada enquanto pratos individuais estão a ser criadas. Não é adequado para assumir que o robô funcionará perfeitamente e deixar o robô para execução autônoma. O operador atento e observador deve estar em um position notar por um som ou uma aparência quando algo não está funcionando corretamente e para corrigi-lo imediatamente. Além disso, cada uma das placas deve ser cuidadosamente inspeccionadas por olho para a uniformidade de conteúdo do poço, logo que a placa é selada e antes de ser colocado afastado para ensaios de cristalização. Isso só deve exigir alguns segundos para executar e pode ser feito enquanto a placa ao lado está sendo carregado. Perceber, por exemplo, que os poços particulares não são devidamente preenchido pode destacar o fato de que um certo precipitante ponta distribuição está funcionando corretamente. Deve entrega de mesofase ser visto para ser irregular, o produto relevante defeituoso teria de ser corrigida imediatamente. Ao notar estes problemas e fazer os ajustes relevantes durante o set up vai poupar tempo e materiais, incluindo lipídios valioso e proteína de membrana. Se um gerador de imagens é usado para acompanhar o crescimento de cristais, exatidão e precisão também pode ser monitorado durante o exame. Por exemplo, problemas sistemáticos com gota ou boluslocalização pelo imageador indicam que algo não está certo e que medidas corretivas em algum lugar a montante no protocolo é necessário. No interesse de um desempenho confiável, portanto, o robô deve ser calibrado em uma programação regular e conforme necessário. Calibrações deve incluir o volume de agente precipitante e mesofase entregue, bem como a colocação de bolus e precipitante no poço. Obviamente, onde quer que possível calibração deve ser feito o uso de volumes e materiais semelhantes aos que serão utilizadas em ensaios realizados no período do exercício de controlo de qualidade. Tão importante quanto a calibração é assim também está a ter em estoque uma quantidade adequada de peças do robô e suprimentos. Falhas catastróficas e inesperada, bloqueios e acidentes podem acontecer. Em tal caso, ter disponível um substituto ponta entrega precipitante, por exemplo, pode significar que uma preparação de proteína da membrana é extremamente valioso utilizado como deveria eque não seja desperdiçado. Algumas das vantagens de um robô incluem o facto de que vai funcionar essencialmente de forma contínua e que não sofra de ou &quot;queixar-se de&quot; fadiga. Um robô também pode ser utilizado sob condições que não sejam consideradas humano-friendly, tais como, no escuro, sob iluminação controladas e das condições ambientais, e a temperaturas extremas. Os robôs demonstrados neste artigo foram todas usadas em condições ambientais a ~ 20 ° C. No entanto, há proteínas e projectos que exigem temperaturas ambientes não-controlada, luz 11,12 e um oxidante ou um ambiente de redução 13. Todos estes podem ser servidos, com relativa facilidade, quando um robô de cristalização é usado. Em um artigo de vídeo anterior JoVE demonstramos como ensaios de cristalização pelo método no meso são configuradas manualmente 1. O volume mínimo de mesofase que pode ser dispensado de forma fiável por mão é limitada by imparcialidade da acuidade visual e constante da pessoa configurar os ensaios. Na nossa experiência, os volumes de mesofase tão baixas como 100 nl são facilmente manipulados. Sabemos de um laboratório onde o volume padrão dispensado manualmente é cerca de 40 nl. No entanto, os volumes consideravelmente menores são possíveis usando um robô. Separadamente, mostrámos que os volumes de mesofase tão baixas como 550 picolitros pode ser dispensada roboticamente 14. Desse trabalho, ficou claro que uma maior miniaturização de robô é possível que, se aplicada, levaria a uma grande redução na quantidade de proteína de membrana valioso necessário para levar a cabo um ensaio de cristalização. Neste artigo de vídeo, três robôs comercialmente disponíveis foram utilizados para demonstrar a high-throughput cristalização de proteínas de membrana utilizando mesofases lipídicas. O primeiro destes foi desenvolvido no Grupo MS &amp; FB com base na nossa experiência configurar manualmente ensaios, tal como descrito no JoVE 1712 1. Este é o instrumento temos mais familiaridade e a maior parte do artigo actual é dedicado à sua utilização. Os outros dois robôs estavam em demonstração no MS &amp; Grupo FB no momento que o artigo foi escrito e as filmagens relevante é incluído aqui, no interesse da completude. Todos os três robôs usar muito o mesmo sistema de distribuição de mesofase, a característica essencial do qual é uma seringa de vidro de deslocamento positivo 5,7. Eles diferem mais significativamente no que se refere à entrega precipitante. 1 e 2, os robôs podem dispensar precipitante simultaneamente em 8 poços, uma única coluna em um prato de cristalização de cada vez. Em contraste, a Robot 3 dispensa todos os 96 precipitantes soluções em uma única ação. Robô 2 é o único instrumento com descartáveis ​​precipitantes dicas de dispensação. Há prós e contras associados com os diferentes instrumentos que dependem da aplicação em particular, estes não serão elaborados aqui. Basta dizer que o trabalho de todos os três e produziram cristais de membrane proteínas pelo método de meso. Os próximos passos do processo global de determinação de estrutura por cristalografia macromolecular são para a colheita e para crio-cool cristais a partir de placas, constituídas como descrito no artigo de vídeo e de registo e de difracção de raio-X processo a partir deles. Esses temas são abordados em artigos separados Jove desta série 1,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Componentes </td></tr><tr><td> Brayer (rolo) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820937 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Seringas de gás </td><td> Hamilton </td><td> 81030 </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Lamínulas </td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td> Descartável </td></tr><tr><td> Placas de vidro </td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td> Descartável </td></tr><tr><td> Gryphon LCP Robot </td><td> Arte Robbins </td><td> NA </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> No meso robô </td><td> Anachem / Gilson </td><td> NA </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Caderno de anotações </td><td> Vário </td><td> NA </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Mosquito LCP Robot </td><td> TTP Labtech </td><td> NA </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Fita espaçador perfurado dupla vara </td><td> Saunders Corporation (perfurados) </td><td> personalizado </td><td> Descartável </td></tr><tr><td> Soluções precipitantes </td><td> Vário </td><td> Vário </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Água purificada </td><td> Millipore </td><td> NA </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> X-chuva </td><td> Shell Cuidados com carros </td><td> 80199200 </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Dicas de seringas </td><td> Hamilton </td><td> 7770-020 (calibre 22) </td><td> Ferramenta </td></tr><tr><td> Tecidos </td><td> Vário </td><td> Vário </td><td> Descartável </td></tr><tr><td> Garrafa de água </td><td> vário </td><td> NA </td><td> Reagente </td></tr></tbody></table>

use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases

Estudos de estrutura-função de proteínas de membrana beneficiar grandemente de ter disponíveis de alta resolução de estruturas 3-D do tipo fornecido através de cristalografia de raios-X macromolecular (MX). Um ingrediente essencial de MX é uma fonte constante de difração idealmente qualidade de cristais. A meso ou em fase lipídica cúbico método (LCP) para cristalizar proteínas de membrana é um dos vários métodos disponíveis para a cristalização de proteínas de membrana. Ele faz uso de uma mesofase bicontinua em que para crescer cristais. Como método, ele teve alguns sucessos espetaculares da tarde e tem atraído muita atenção com grupos de pesquisa já muitos interessados ​​em usá-lo. Um dos desafios associados ao método é que a mesofase hospedagem é extremamente viscoso e pegajoso, que lembra uma pasta de dente de espessura. Assim, dispensando-lo manualmente de forma reproduzível em pequenos volumes em poços de cristalização requer habilidade, paciência e uma mão firme. Um protocolo para fazer juª que foi desenvolvido na membrana estrutural e funcional Biologia (MS &amp; FB) Grupo 1-3. Artigos de vídeo Jove que descrevem o método são 1,4 disponíveis. A abordagem manual para a criação em meso ensaios tem vantagens distintas, com aplicações especiais, tais como otimização de cristal e derivatização. Isto, contudo, sofrem de ser um método de baixo volume de produção. Aqui, nós demonstramos um protocolo para a realização de ensaios de cristalização meso roboticamente. Um robô oferece as vantagens de rapidez, exactidão, precisão, miniaturização e ser capaz de trabalhar continuamente durante períodos prolongados sob o que poderia ser considerado como condições hostis como no escuro, numa atmosfera redutora ou a temperaturas baixas ou elevadas. Um robot de meso, quando utilizados de forma adequada, pode melhorar significativamente a produtividade da estrutura da proteína de membrana e de pesquisa de função ao facilitar a cristalização, que é um dos passos lentos naoleoduto determinação global da estrutura. Neste artigo de vídeo, que demonstram a utilização de três robôs comercialmente disponíveis, que pode dispensar a mesofase viscoso e pegajoso integrante no crystallogenesis meso. O primeiro robô foi desenvolvido no MS &amp; Grupo FB 5,6. Os outros dois tornaram-se recentemente disponíveis e são incluídos aqui para ser completo. Uma visão geral do protocolo abordado neste artigo é apresentado na Figura 1. Todas as manipulações foram efectuadas à temperatura ambiente (~ 20 ° C) sob condições ambiente.

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Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Aqui é descrito um método para robótica de alto rendimento de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicos para utilização na determinação da estrutura utilizando a cristalografia de raios-X macromolecular. Três robôs capazes de lidar com o viscoso e pegajoso mesofase proteína-laden integrante do método são introduzidos.

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

use-robot-for-high-throughput-crystallization-membrane-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

17.4K visualizações.  Trinity College Dublin. Aqui é descrito um método para robótica de alto rendimento de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicos para utilização na determinação da estrutura utilizando a cristalografia de raios-X macromolecular. Três robôs capazes de lidar com o viscoso e pegajoso mesofase proteína-laden integrante do método são introduzidos.

Vídeo: Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Biologia

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Cristalização de proteínas para cristalografia de raios X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...