Há muitos que contribuíram para este trabalho ea maioria são da membrana Caffrey estruturais e Grupo de Biologia Funcional, ambos membros do passado e do presente. A todos nós estendemos nossos mais sinceros agradecimentos e apreço. Este trabalho foi financiado em parte por doações da Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), o National Institutes of Health (GM75915), e da Universidade de Limerick.

Um foco importante na área de biologia estrutural e funcional é a membrana biológica (Figura 1). A membrana, que envolve a célula e sub-celular organelas quando presente, é uma estrutura molecular fina apenas duas moléculas lipídicas de diâmetro e está repleta de proteínas. Estrutura e função como aplicadas a ambos os lipídios e as proteínas são de interesse. No entanto, o foco deste artigo se restringe a proteínas da membrana. Uma melhor compreensão de como as proteínas da membrana funcionam em um nível molecular é procurado por duas razões. Em primeiro lugar, há a satisfação intelectual em saber como eles funcionam. Em segundo lugar, por saber como funciona uma proteína, há sempre a perspectiva de ser capaz de corrigi-lo deveria mau funcionamento ou de melhorar ou mesmo modificá-lo para aplicações específicas. Desenho de drogas é um resultado óbvio deste tipo de trabalho. Uma abordagem a figurar como uma proteína de membrana funciona em um nível molecular é determinar a sua estrutura. Isso implica o estabelecimento do local em 3-dimensional do espaço de todos os átomos, ou pelo menos todos os átomos não hidrogênio, que compõem a proteína. O método que utilizamos para este fim é a cristalografia macromolecular de raios-X (MX). A Figura 2 mostra um exemplo de uma proteína de membrana cuja estrutura foi determinada usando MX. Um cristal de difração de qualidade da proteína é obrigado a fazê-MX. Claramente, há muitas etapas envolvidas na determinação da estrutura usando cristalografia de macromoléculas. Isto é ilustrado na Figura 3. Normalmente, estas incluem a identificação de uma proteína de membrana-alvo, e depois produzir, purificar e cristalizar-lo. Medidas de difração são realizadas sobre o cristal com uma casa ou um síncrotron fonte de raios-X. Os dados de difração são processados ​​gerando um mapa de densidade de elétrons, que depois é equipado com um modelo molecular. O modelo, quando refinado, pode ser usado para explorar o mecanismo de ação da proteína e para a estrutura baseada em desenho de drogas. O foco deste artigo é mostrar como se produz cristais de difração de qualidade de proteínas da membrana lipídica utilizando mesofases, pela chamada no método meso. Uma recente revisão do método e seu escopo está disponível na Referência 1 (Caffrey, 2009). O protocolo passo a passo vamos seguir aqui é descrito na referência 2 (Caffrey e Cherezov, 2009). Um fluxograma resumindo as etapas envolvidas e tempo necessário para a criação de um julgamento no meso cristalização de proteínas da membrana é mostrado na Figura 4. Este artigo abrange os passos delimitada por linhas tracejadas vermelhas. Parte 1: Preparação das Placas Cristalização <ol><li> A posição de uma lâmina de microscópio silanizadas na bancada de trabalho. </li><li> Remova a tampa do papel de proteção de uma superfície de uma tira de fita dupla espaçador vara perfurado (comercialmente disponíveis, consulte a Tabela de Reagentes e equipamentos específicos abaixo). </li><li> Coloque a fita lado, pegajoso para baixo, em contato com a superfície da lâmina. </li><li> Pressão selo a fita para o slide usando um Brayer ou rolo. Folha de alumínio pode ser colocado entre a fita eo rolo de proteger a base dos poços. </li><li> Remova a tampa do papel segundo a partir da fita para expor a sua superfície superior pegajosa. </li><li> Lugar individual lamínulas silanizadas em estreita proximidade com a chapa para a selagem rápida e eficiente de poços, assim como a carga está completa. </li></ol> Parte 2: Preparar a seringa Lipid <ol><li> Coloque o lipídio (muitas vezes monoolein) em um bloco com temperatura controlada a 45 ° C por 3 minutos para torná-lo derretido. </li><li> Enquanto o lipídio está derretendo preparar dois 100-mL seringas à prova de gás para uso Hamilton na etapa de lipídios proteínas mistura. Remova a ponteira Teflon da seringa que irá conter a solução de proteína. Coloque a seringa que conterá o lipídio ao lado dele (deixando a sua ponteira no lugar). </li><li> Conecte o acoplador (ver Tabela de Reagentes e equipamentos específicos abaixo e Referência 3 (Cheng et al., 1998)) para a seringa de lipídios. Dedo a apertar o acoplador à seringa, mas não aperte demais. Remover o êmbolo do cilindro da seringa lipídico. </li><li> Note-se que o lipídeo deve ser derretido antes de prosseguir. Definir a pipeta a 30 mL e, lentamente, levar até cerca de 30 mL de lipídios fundido. Lentamente entregar o máximo de lipídios derretida como você pode na extremidade aberta da seringa tomando cuidado para não introduzir aberturas de ar. </li><li> Coloque o êmbolo para o barril em contato com o lipídio derretido e lentamente avançar o êmbolo até o barril com a seringa na posição vertical, como demonstrado no vídeo. Bolhas de ar que pode ser preso, inadvertidamente, deve subir no processo e ser liberado. </li><li> Determinar cuidadosamente o volume de lipídios na seringa lendo as marcas do corpo da seringa. </li><li> Deslize a ferrULE para a agulha que se estende do acoplador. Use o êmbolo para forçar o lipídio derretido até o barril e lenta e suavemente para dentro da agulha no centro do engate. </li></ol> Parte 3: Preparando a Seringa Protein <ol><li> A solução de proteína deve ser centrifugado a 14.000 g por 5 a 10 minutos a 4 ° C para remover grandes agregados antes da criação de ensaios de cristalização. Remover a solução de proteína a partir do gelo e deixe-a equilibrar à temperatura ambiente. </li><li> Calcular o volume de solução de proteína a ser usada para formar a fase cúbica em ou perto de hidratação completa. Para monoolein a 20 ° C, a hidratação completa com água ocorre em cerca de 40% de água (em massa), como no diagrama de fase 5 (Figura 5). </li><li> Com uma seringa de Hamilton de 25 ou 50 mL levar até o volume necessário de solução de proteína. Transferir a solução na ponta de teflon do êmbolo no corpo da seringa proteína tomando cuidado para evitar bolhas de ar. </li><li> Cuidadosamente retire a agulha e medir o volume de solução de proteína na seringa. Ele deve corresponder ao valor entregue no passo anterior. </li><li> Lentamente, centímetro a solução de proteína até o barril para acabar lave com sua extremidade aberta. </li><li> Parafuso a seringa de proteína na extremidade aberta do acoplador anexado à seringa lipídico. É fundamental que o dispositivo não ser excessivamente apertada. O aperto excessivo o dispositivo montado mistura nesta fase irá danificar o virolas e causar vazamento. Sub-aperto também vai levar ao vazamento. </li></ol> Parte 4: solução de proteína Mistura e Lipid: Fazendo a mesofase <ol><li> Para efeito de mistura, o avanço do êmbolo do lado de proteína da unidade montada mistura ao seu limite, com o polegar ou dedo indicador condução da solução de proteína da seringa proteína, através do acoplador e com a seringa de lipídios. </li><li> O êmbolo do lado de lipídios é usado agora para dirigir o conteúdo da seringa de lipídios de volta através do acoplador e na seringa proteína. </li><li> O processo é repetido muitas vezes, ocasionalmente, uma centena de passagens ou mais são necessários para produzir uma mesofase homogênea. No início da mistura, o movimento de material e para trás através do acoplador pode ser desigual e, às vezes, força extra é necessária para efeito de mistura. Mistura inicial é geralmente acompanhada pelo desenvolvimento de uma nebulosidade não-uniforme na amostra. Como homogeneização progride, a textura torna-se mais uniforme e característicos da fase viscosa cúbicos, assim como o aspecto visual da mesofase emergentes cúbicos. </li><li> Se as condições forem apropriadas e as formas de fase cúbica, a dispersão deve aparecer opticamente transparentes na seringa. Assim, as marcas no corpo da seringa deve ser claramente legíveis através da mesofase no barril. </li><li> Resfriamento muito ligeiro da amostra durante a mistura, colocando o mixer seringa para um curto período de tempo no gelo pode acelerar a homogeneização ea obtenção de transparência. No entanto, é importante não arrefeça demasiado a amostra. </li><li> Cuidados devem ser tomados para evitar extremamente vigorosa mistura, pois isso pode causar a temperatura da amostra a subir devido ao aquecimento por fricção 3. </li></ol> Parte 5: Carregando a Dispenser <ol><li> Remova a agulha e do êmbolo de uma seringa Hamilton de 10 mL. Deixe a ponteira de teflon no lugar. </li><li> Remova a porca de fixação do dispensador com a ajuda de uma pequena moeda. </li><li> Com o braço da catraca totalmente retirado, insira a seringa - sem o seu êmbolo e agulha - por meio do anel de realização do dispenser. </li><li> Substitua a porca de fixação, junta lado voltado para a seringa, e aperte-o firmemente no na extremidade aberta da seringa. Cuidados devem ser tomados para garantir a seringa está devidamente centrada no anel exploração e que o barril está alinhado paralelo ao braço da catraca. Ambos podem ser julgados por olho. Esses dois requisitos são fundamentais para evitar vazamentos. </li><li> Passe o êmbolo através do anel de aperto com a porca garra retirado algumas voltas e orientar o êmbolo na extremidade aberta da seringa. Deprimir o braço totalmente catraca. Mover o êmbolo para dentro do cilindro e verificar se ele viaja livremente e verdadeiro no barril. Ela pode ajudar a soltar o parafuso na barra de guia para facilitar o êmbolo se movendo livremente. Certifique-se que ele faz. O êmbolo até a sua ponta de teflon alinha com a marca de graduação de zero mL sobre o barril. Se o parafuso na barra de guia foi solto, reaperte-lo e verifique novamente o êmbolo que se move livremente. </li><li> Mover o êmbolo de um lado da unidade montada mistura à marca de graduação de zero mL para transferir a mesofase para a outra seringa e do acoplador. </li><li> Desconectar a seringa vazia (com sua ponteira no lugar) da unidade de mistura e imediatamente se conectar a seringa carregada - com o acoplador de umttached - com a rescisão threaded da seringa dispensar 10-mL. O grau de aperto com que o acoplamento é feito é crítica, como já assinalado. </li><li> Carregar a seringa dispensando pressionando o êmbolo da seringa de 100 mL, para que as transferências mesofase através do acoplador. </li><li> Segura uma pequena, agulha de ponta chata para a rescisão de aço da seringa distribuição e aperte cuidadosamente no lugar. </li><li> Prender o êmbolo para o braço da catraca, apertando a porca no anel de fixação. Cuidados devem ser tomados para não aperte demais a porca, pois isso pode marcar e deformar o êmbolo tornando-o inutilizável. É importante que o intervalo de viagem previsto para o braço da catraca na condição de preso ser limitado a não mais do que uma polegada, como demonstrado no vídeo. Além disso, o êmbolo vai ter uma tendência a fivela e entrega pode falhar. </li><li> Deprimir o tambor catraca várias vezes para avançar o êmbolo no barril, preenchendo assim o volume vazio da agulha e carregamento da agulha. Esta etapa deve ser repetida (até dez vezes) até que uma seqüência contínua da mesofase emerge a partir da ponta da agulha. </li><li> Ensaios de cristalização deve começar imediatamente, já que algumas proteínas são instáveis ​​na fase cúbica sem precipitante acrescentou. </li></ol> Parte 6: Configurando Placas Cristalização <ol><li> Colocar uma placa de cristalização multi-bem e lamínula sobre uma superfície levantou alguns centímetros acima da bancada de trabalho para facilitar o carregamento. Um óptimo contraste e visibilidade são alcançados quando a superfície é um pouco escuro. </li><li> Homogeneizar as soluções precipitante e uncap os frascos. Definir a distribuição de pipeta precipitante de 1 mL. </li><li> Com a seringa na posição vertical dispensar em uma mão, use a mão livre para posicionar a ponta da agulha no centro e diretamente acima da base do número bem 1. Pressione o botão no dispensador repetindo para expulsar um bolus de mesofase na superfície de vidro. O volume de bolus é de 200 nL quando o dispenser padrão de repetição é usada com uma seringa de 10 mL. A ponta da agulha deve ser não mais do que algumas centenas de micrômetros acima da base do poço para garantir a entrega adequada. </li><li> Depois de quatro poços adjacentes são carregados com mesofase, coloque 1 mL de solução precipitante em cima de cada bolus mesofase usando uma pipeta de 2 mL e as pontas descartáveis. </li><li> Tão rapidamente quanto possível, coloque uma lamela diretamente sobre os poços cheios para cobri-los de maneira uniforme. Para efeito de um selo à prova d&#39;água, use uma espátula para aplicar pressão sobre a lamela onde faz contato com a superfície exposta da fita adesiva espaçador. </li><li> A mesofase e processo de distribuição precipitante pode ser repetido até que todos os poços na placa são carregados e lacrados. </li><li> Etiqueta da placa claramente para fins de controle. Proteínas sensíveis à luz são normalmente tratadas por envolvimento das placas em papel alumínio antes de colocá-los na câmara de incubação. </li><li> Coloque as placas em uma câmara com temperatura controlada, geralmente a 20 ° C. </li><li> Em uma programação regular, fiscalizar os poços para o crescimento de cristais usando um microscópio de luz polarizada com um objectivo de 10 ou 20 vezes. A programação utilizada no laboratório do autor é a seguinte: dia 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 e 60 pós-instalação. Inspecione cuidadosamente o bolo mesofase ajustar a profundidade do foco dentro da amostra 0,14 mm de espessura. Exame deve ser feito tanto na luz normal e cruzado entre polarizadores. </li></ol> Parte 7: Resultados Representante O aparecimento dos cristais resultantes variam de acordo com a cor inerente à proteína de membrana, a polarização da luz usada para a inspeção (ou falta dela) e do método e da qualidade de iluminação. A Figura 6 mostra várias aparições de cristal possível. Proteínas da membrana naturalmente colorido crescer em meso quando vistas com luz normal pode olhar como os mostrados na Figura 6 (b Painéis e d). Cristais incolores membrana proteína crescente na fase cúbicos quando vistas com luz normal pode olhar como os mostrados na Figura 6 (Painel e). Finalmente, os cristais de proteína de membrana incolor crescer em meso quando vistas com luz polarizada pode ser semelhante à Figura 6 (painéis A e C). Os próximos passos no processo global de determinação de estrutura são a colheita e crio-cool dos cristais e para registrar e analisar difração de raios X a partir deles. Esses tópicos devem ser cobertos em artigos JOVE separado. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Representação esquemática de uma membrana biológica mostrando a bicamada lipídica e em que estão situados a uma variedade de proteínas. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A estruturada vitamina B transportar BtuB proteína 12,, resolveu usar MX e cristais crescidos pelo método 6 em meso ilustrado neste artigo Jove. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. O ciclo estrutura-função ilustra muitas das etapas envolvidas na obtenção e utilização de informações estruturais completas sobre uma proteína. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. O fluxograma resume as etapas envolvidas na produção de cristais de proteína de membrana pelo método em meso. Apenas os passos rodeada pela linha tracejada vermelha são abordados neste artigo Jove. De Referência 2. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Um diagrama de fases simplificado temperatura-composição para os lipídios (monoolein) / sistema de água. Ensaios de cristalização são criados a 20 ° C onde os lipídios saturados com água a hidratação de 40%. O diagrama de fases detalhadas estão disponíveis na referência 5. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Cristais de proteínas da membrana crescente na mesofase lipídica. (A) de vitamina B 12 proteína transportadora, BtuB 6, (b) decolheita complexo II 7, (c) a OPCA adesina / invasin 8, (d) bacteriorodopsina 9, (e) transportador um hidrato de carbono a partir de Pseudomonas. As imagens gravadas com a luz normal (b, d, e) e entre polarizadores cruzados (a, c).

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	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter,+BtuB,+at+1.95+A+resolution.">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin.">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li></ol>

A fase cúbica é um ambiente delicado e dinâmico que pode mudar drasticamente com a alteração de um número de variáveis. Não é possível dar uma descrição da configuração do em ensaios de cristalização meso no modo manual que descreve todos os potenciais armadilhas. No entanto, muitas dificuldades podem ser evitadas através da prática da técnica antes de a aplicar soluções de proteína caro e usando moderação em pressão aplicada a seringas durante a mistura. Feito corretamente, o método em meso pode produzir cristais de uma grande variedade de proteínas, cujo número não pára de aumentar. A descrição dada aqui da configuração de em ensaios de cristalização meso é focado no modo manual. O processo pode ser, e muitas vezes é modificado para facilitar a configuração automática das placas de cristalização nos casos que exigem grande escala de rastreio das condições de cristalização.

* Todos os detalhes para a usinagem de seus próprios Coupler Bore Narrow são fornecidos na Referência 3.

crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases

Um protocolo detalhado para cristalizar proteínas da membrana usando mesofases lipídica é descrita. Este método tem diversas sido referido como a fase lipídica cúbicos ou no método meso. O método tem se mostrado bastante versátil na medida em que tem sido utilizado para resolver de raios-X estruturas cristalográficas de proteínas procariotas e eucariotas, as proteínas que são monoméricas, homo e hetero-multimérica, contendo cromóforos e cromóforo-free, e alfa -hélice e proteínas beta-barril. Sucessos recentes usando em cristalização meso são os humanos engenharia beta2-adrenérgico e adenosina A2a G receptores acoplados à proteína. Protocolos são apresentados para reconstituir a proteína de membrana para a mesofase monoolein de base, e para a criação de cristalizações no modo manual. Etapas adicionais no processo global, como a colheita de cristal, estão a ser abordados em artigos de vídeo futuro. O tempo necessário para preparar a mesofase proteína-carregados e para configurar uma placa de cristalização manualmente é cerca de uma hora.

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Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Aqui é descrito o procedimento implementado no Grupo Biologia Caffrey Membrana Estrutural e Funcional para configurar manualmente ensaios de cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

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Research

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Biology

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The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Biologia

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinação de concentração de ácidos nucléicos e proteínas Usando o Micro-volume Bio-spec Espectrofotômetro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secundária Previsão Estrutura Usando SHAPE de alta capacidade

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...