Este trabalho foi financiado pela DFG-Cluster de Excelência &quot;Inflamação na Interfaces&quot; (RA-Se, RA-D). Somos gratos pela excelente assistência técnica de Kristin Wischnat.

1. Preparação de Chlamydia trachomatis Ações D Serovar <ol><li> Infect confluente 175 centímetros 2 balão de cultura de células HeLa contendo-229 células com 4 ml C. D trachomatis no SPG buffer. </li><li> Incubar durante uma hora a 37 ° C durante agitação constante. </li><li> Adicionar 20 ml de DMEM com FCS 10% e 240 uL Cicloheximida. </li><li> Incubar numa incubadora humidificada durante 48 h, a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 5 ml pérolas de vidro estéreis, agitação forte para retirar e destruir C. trachomatis abrigando HeLa-229 células. </li><li> Recolher o sobrenadante e adicionar mais 5 ml de pérolas de vidro estéreis. </li><li> Rocha três vezes durante 1 min para destruir todas as células HeLa-229 e libertação C. trachomatis. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI e 4 ° C para se livrar de detritos celulares. </li><li> Recolher o sobrenadante para a infecção de 8 a 10 175 cultura de células cm 2 balões g confluenterown com HeLa 229 células. </li><li> Incubar a cada frasco com 4 ml de tampão SPG e 4 ml de sobrenadante infecção anterior durante uma hora a 37 ° C com agitação constante. </li><li> Depois de uma hora adicionar 15 ml de DMEM com FCS 10% e 230 uL cicloheximida seguido por 48 h de incubação a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 5 ml pérolas de vidro estéreis, agite para retirar e destruir C. trachomatis abrigando HeLa-229 células. </li><li> Recolher o sobrenadante e adicionar mais 5 ml de pérolas de vidro estéreis. </li><li> Rocha três vezes durante 1 min para destruir todas as células HeLa-229 e libertação C. trachomatis. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI a 4 ° C para se livrar de detritos celulares. </li><li> Recolher o sobrenadante. </li><li> Encha 40 ml de sobrenadante em tubos de 50 ml Falcon, centrifugar durante 99 min com 11.000 RPMI. </li><li> Após centrifugação descartar o sobrenadante e lava-se o sedimento com 1 ml de tampão SPG. </li><li> Homogeneizar asedimento em 1 ml e SPG uL alíquota de 20 em um 1 5 ml, tubo Eppendorf loja, a -70 ° C até à utilização. A actividade biológica do stock preparada foi confirmada em uma estabelecida HeLa-229 modelo de infecção da célula. </li></ol> 2. Preparação da trompa de Falópio Humanos <ol><li> Armazenar humanos trompas de Falópio (HFT) de mulheres submetidas a histerectomia imediatamente após a cirurgia em RPMI contendo FCS a 5% sem antibióticos em 4 ° C até preparação. O protocolo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Lübeck (09-153). As mulheres incluídos no estudo (idade 34 até 53) não tinha história de C. antes trachomatis infecção. Tecido das trompas de Falópio foi coletada no periparto de esterilização, a pedido da mãe durante a cesariana ou durante histerectomias devido a fibróides uterinos sintomáticos na fase lútea. Todos HFT foram negativas para o C. trachomatis por PCR. </li><li> Dissecar a HFT numa placa de Petri contendo meio RPMI com5% de FCS sem antibióticos. Durante o processamento todo o tecido deve ser submersa em meios para evitar a secagem. </li><li> Corte e descarte do tecido conjuntivo e tecido destruído durante a cirurgia. </li><li> Após a dissecção abrir o HFT cuidadosamente com um bisturi de pequeno porte. </li><li> Para mais experiências preparar pedaços de tecido no tamanho de 0,5 cm x 0,5 cm até 1 cm x 1 cm. </li><li> Para a infecção espécime HFT loja em 1 ml de RPMI contendo FCS 5% sem antibióticos. Espécimes HFT foram infectadas com 5.5x10 5 IFU (unidades formadoras de inclusão) de C. trachomatis. </li><li> Incubar espécime HFT em 37 ° C, 5% de CO 2 e 21% de O 2, bem como em 37 ° C, 5% de CO 2 e 2% de O2 durante 24 h. </li><li> Após período de incubação coletar amostra e loja em fixador Monti para pelo menos três dias a 4 ° C até SEM / TEM preparação. </li></ol> 3. Preparação de amostras para TEM HFT <ol><li> ParaMET remover espécime de fixador Monti e cortar 2 x 2 mm a 4 x 5 pedaços mm. O tecido restante pode ser utilizada para MEV. </li><li> Lavar peças com tampão de cacodilato de sódio, pH 7,35 para 1 h. </li><li> Incubar em 1% (w / v) de tetróxido de ósmio em água destilada. durante a noite. </li><li> Remover o excesso de tetróxido de ósmio por lavagem min 6x5 em tampão de cacodilato de sódio, pH 7,35. </li><li> Remover a água por incubação em concentrações crescentes de etanol em água (v / v) (30% durante 2 h, 40% durante 2 h, 50% durante 2 h, 60% durante 2 h, 70% durante a noite, 80% para 2 h, 90% durante 1 h, 95% durante 1 h, 100% durante 1 h. </li><li> Lavar a etanol para 2 x 15 min em óxido de propileno e subsequentemente transferidos para uma mistura de 50% (v / v) araldite recentemente preparado (incluindo todos os componentes) em propileno e incubar durante a noite. </li><li> Transferência para araldite preparada de fresco (incluindo todos os componentes) durante pelo menos 1 h. </li><li> Transferir para moldes de incorporação de planos e preencher com araldite. </li><li> Deixe endurecer por aralditepelo menos 48 horas a 60 ° C </li><li> Após o corte da amostra incorporado corte semi cortes finos (700 nm) em um ultramicrótomo usando facas de vidro ou uma histo faca de diamante e manchar com mancha de Richardson. </li><li> Corte cortes ultrafinos de (aprox. 70 nm), utilizando uma faca de diamante e transferência para grades de cobre (por exemplo 150 mesh quadrado). </li><li> Stain ultra-finas secções com acetato de uranilo a 0,5% (w / v) em água destilada. seguido por 3% (w / v) de citrato de chumbo em água destilada. em um Stainer secção automático. Alternativamente, as secções podem ser corados manualmente, deixando grades 15 min em uma solução saturada de acetato de uranilo centrifugada em água destilada. seguido por citrato de chumbo 0,3% (w / v) em água destilada. </li></ol> 4. Preparação da amostra HFT para MEV <ol><li> Para remover SEM amostra de fixador Monti, orientar com epitélio voltado para cima em uma folha de cortiça 1,5 x 1 cm e fixar a posição usando agulhas de insetos. </li><li> Transferência espécime em cortiça para cestos metálicos adequados elave durante 30 min em tampão de cacodilato de sódio, pH 7,35. </li><li> Remover a água por incubação de amostra em concentrações crescentes de acetona / água misturas (v / v) 30% durante 6 h, 40% durante 6 h, 60% durante 8 h, 70% durante a noite, a 80% durante 2 h, 90% para 2% e 100 h durante a noite (ser extremamente cautelosos para manter espécime continuamente submerso). </li><li> Transferência para acetona a 100% fresco e amostra seca por secagem por ponto crítico (temperatura 40 ° C, pressão 80 bar). </li><li> Remover as agulhas, cortiça e espécimes cola com o epitélio voltado para cima sobre SEM montagem exemplar equipado com um guia de carbono condutora utilizando cimento de carbono condutora. Use prata condutora de líquido para aumentar a condutividade entre o suporte ea guia de carbono condutora. </li><li> Preparar um revestimento de ouro, platina ou paládio condutora da amostra, utilizando um revestidor por crepitação. </li></ol> 5. A coloração do Semi Seções finas com Stain Richardson <ol><li> Vamos semi seções finas seca em slide. </li><li> Stain secções com coloração solução a 60 ° C durante 1-2 min. </li><li> Lave em água destilada. </li><li> Trechos secos e lamela. </li></ol> 6. Os resultados representativos Dentro do modelo de infecção da trompa de Falópio humano fomos capazes de visualizar as diferenças na morfologia epitelial entre os controles não infectados (Figura 1) e do C. trachomatis - tubos infectados (Figura 2) sob condição normóxica. Característicos diferenças morfológicas implícita patógeno induzida por inchaço e lise de células epiteliais de trompas que não puderam ser detectados em controlos não infectados. Usando meias seções delgadas e microscopia eletrônica de transmissão pudemos provar C. intracelular formação trachomatis inclusão no tecido infectado ex vivo tubo falópico humana (Figura 3, 5), mas não em controles não infectados (Figura 4). Como concentração de oxigênioções no trato genital feminino já são baixas em condições fisiológicas 11, e diminui ainda mais durante um processo inflamatório que também investigou o nosso modelo sob condições de hipóxia. Os resultados preliminares indicam que o modelo é útil para analisar o crescimento clamídia e descendentes em diferentes concentrações de oxigênio. Chlamydia induzida danos em células epiteliais tem de ser separado de artefactos que são mediadas através da preparação e manuseamento descuidado das trompas de Falópio antes da infecção (Figura 6). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de uma Falópio não infectado humano após um dia de incubação em meio de controle (seta verde mostrar ciliado célula seta azul mostra não-ciliado célula). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Eletrônica de varredura micros<html> cópia de varredura (MEV) de um ex C. trachomatis vivo infectado trompa de Falópio humana uma infecção pós dia (seta branca inclusão marca de ruptura). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Semi lâminas delgadas mostram típicas inclusões intracelulares (setas brancas) 1d após a infecção do tubo de falópio humana com C. ex vivo trachomatis. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. Microscopia de transmissão de electrões (TEM) de um não-infectada tubo falópico humano após uma incubação dias em meio de controlo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="A Figura 5" /> A Figura 5 microscopia electrónica. De transmissão (TEM) de uma ex vivo C. trachomatis infectado trompa de Falópio humana uma infecção pós dia (setas brancas marcar inclusões clamídia). ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="A Figura 6" /> Figura 6. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) do epitélio trompa de Falópio danificada através da preparação e manuseio descuidado de amostra (branco setas marca destruído o tecido epitelial).

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	<li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping.">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li><li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility.">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li><li>Peipert, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Genital+chlamydial+infections.">Clinical practice. Genital chlamydial infections.</a> N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).</li><li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubal+factor+infertility,+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis.">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li><li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells.">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55 (2006).</li><li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells.">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li><li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection.">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li><li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo.">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li><li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin.">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li><li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring.">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Visualização do patógeno-induzido dano ao tecido infectado é árdua e muitas vezes limitado a procedimentos experimentais em camundongos. Nós estabelecemos um modelo de infecção ex vivo em humanos trompas de Falópio para analisar C. infecções do tracto trachomatis fêmea genital superior. Através da utilização deste método, fomos capazes de visualizar C. trachomatis - dano induzido ao epitélio humano tubo de falópio dentro de uma infecção pós dia. Edema celular e lise eram típicas alterações morfológicas que foram observados em C. trachomatis - infectadas trompas de Falópio, mas não em controlos não infectados. Análises em MET revelaram que clamídias implementar um ciclo típico de desenvolvimento intracelular nos tecidos infectados, mostrando inclusões de grande porte com re diferenciadas corpos elementares, mas também inclusões menores, com corpos reticulados ampliadas que podem indicar a persistência. No entanto, o quadro morfológico sozinho não é suficiente para discriminar entre replinfecções icating e persistentes, que são caracterizadas por metabolismo reduzido e uma maior resistência aos agentes antimicrobianos 10. Destruição do epitélio de infectados trompas de falópio ou é devido ao rompimento de C. trachomatis - infectadas células epiteliais após a conclusão do ciclo de desenvolvimento intracelular e libertação de infecciosas corpos elementares ou a libertação de citoquinas pró-inflamatórias 8. Induzida por patógeno dano tecidual e de acolhimento induzidas reações imunes contra C. trachomatis devem ser os principais fatores que levam à perda da função das células epiteliais, fibroblastos e remodelação infertilidade tubária, finalmente, in vivo 8,11. Uma das principais limitações deste modelo é a ausência de células inflamatórias que dificulta a análise dos efeitos secundários para o C. inicial trachomatis infecção do epitélio trompa de Falópio. No entanto, o modelo é apquada para investigar diferentes condições ambientais (por exemplo, o teor de oxigénio) e da resposta do hospedeiro-imune inicial em C. aguda trachomatis 8,9. Existem planos para se estabelecer um modelo para testes de antimicrobianos contra C. trachomatis em toda humanos trompas de falópio e caracterizar os estados metabólicos dos diferentes estágios de desenvolvimento observadas no epitélio das trompas por 2-fótons microscopia de varredura a laser.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloheximida </td><td> Sigma - Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPG Tampão </td><td> vário </td><td></td><td> veja a receita abaixo </td></tr><tr><td> Fixador Monti </td><td> vário </td><td></td><td> veja a receita abaixo </td></tr><tr><td> tampão de cacodilato de sódio </td><td> vário </td><td></td><td> veja a receita abaixo </td></tr><tr><td> Richardson da mancha </td><td> vário </td><td></td><td> veja a receita abaixo </td></tr></tbody></table> Receitas: 1. SPG Tampão <ol><li> Adicionar 75 g de sacarose. </li><li> Adicionar 2,47 g de fosfato dissódico. </li><li> Adicionar 0,36 g de fosfato monossódico. </li><li> Adicionar 0,72 g de ácido glutâmico. </li><li> Preencha a 1 l com água destilada. </li><li> Ajustar o pH a 7,3. </li></ol> 2. 0,1 M de tampão cacodilato de sódio, pH 7,35. <ol><li> Adicionar 42,80 g dimethylarsenic sal sódico do ácido. </li><li> Adicionar 68,46 g de sacarose. </li><li> Preencha a 1 l com água destilada. para obter 0,2 M tampão de cacodilato de sódio. </li><li> Antes de usar solução diluída com água destilada. a desejada concentração e ajustar o pH a 7,35, se necessário. </li></ol> 3. Fixador Monti <ol><li> Adicionar 156 ml 0,12 M de tampão cacodilato de sódio. 3,2 Adicionar 25 ml glutaraldeído 25% em água destilada. </li><li> Adicionar 19 mlParaformaldeído 10% em água destilada. </li><li> Adicionar 3 ml de 3% CaCl 2 em água destilada. </li><li> Ajuste o pH para 7,35 e encha com água destilada. a 312 ml de solução final. </li></ol> 4. Richardson mancha <ol><li> Misturar partes iguais de azul de metileno a 1% em solução aquosa a 1% de bórax e 1% Azur II em água destilada. </li></ol>

a human fallopian tube model for investigation of c. trachomatis infections

Infecções do trato genital por Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) são as mais freqüentes doenças sexualmente transmitidas em mulheres em todo o mundo. Depuração ineficiente ou persistência dos patógenos pode levar a infecções ascendentes do trato genital e é suposto causar danos inflamatória crônica de 1,2 tecidos infectados. Como consequência, sequelas clínicas graves como a doença inflamatória pélvica (DIP), oclusão tubária e infertilidade pode ocorrer 3,4. A maioria das pesquisas com C. trachomatis foi conduzida em linhas de células epiteliais (por exemplo, células HEp-2 e HeLa-229) ou em ratinhos. No entanto, como com a célula de cultura de modelos baseados, eles nem reflectir a fisiologia do tecido nativo nem a patofisiologia da C. infecções do tracto genital trachomatis in vivo 5. Limitações adicionais são dadas pelo facto de cascatas de sinalização centrais (por exemplo IFN-γ MEDIATed JAK / STAT via de sinalização) que controlam o crescimento intracelular por clamídia diferem fundamentalmente entre ratos e seres humanos 6,7. Nós e os outros, portanto, estabeleceu um conjunto de órgãos modelo trompa de Falópio para investigar interações diretas entre C. trachomatis e humano da trompa de Falópio ex vivo de células 8,9. Para este efeito, humanos trompas de Falópio de mulheres submetidas a histerectomia foram recolhidas e infectados com C. trachomatis serovar D. Dentro de 24 h após a infecção amostra, onde analisadas em microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para detectar Chlamydia trachomatis mediada dano epitelial, bem como C. formação trachomatis inclusão no tecido de Falópio.

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A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Nós descrevemos um<em&gt; Ex vivo infecção</em&gt; Modelo para a visualização de interações diretas de patógenos bacterianos com células de trompas. O modelo de tecido inteiro órgão foi estabelecido para investigar<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Patologia induzida ao tubo de falópio feminino em &quot;life-like&quot; condições.

Um Modelo de Tubo de Falópio Humanos para Investigação de<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Infecções

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient ...

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Medicine

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

12.8K visualizações.  University of Lübeck. Nós descrevemos um Ex vivo infecção Modelo para a visualização de interações diretas de patógenos bacterianos com células de trompas. O modelo de tecido inteiro órgão foi estabelecido para investigar C. trachomatis Patologia induzida ao tubo de falópio feminino em "life-like" condições.

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Processamento da mamoplastia redutora e tecidos humanos Mastectomia para cultura de células

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modelo Murino de Cicatrização

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Indução de Aterosclerose Acelerada em Camundongos: O Modelo de "Lesão por Fio"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to the lack of markers or tools for the ovarian cancer identification, the early detection of HGSC remains challenging. Direct sampling of the fallopian tube can enhance sensitivity for detection of neoplastic cells when the tumor is not grossly visible. We developed a procedure to collect fallopian tube cells directly from freshly received surgical specimens, which has shown excellent correlation with histological findings. This approach lays a foundation for the future utility of minimally invasive laparoscopic screening in high-risk patient populations.

We explored a tubal cytologic method by sampling the fallopian tube directly post-surgical excision as a tool of ovarian cancer early detection. Here, we present a protocol to collect fallopian tube cells from freshly received surgical specimens.

Citologia tubária do tubo de Falópio como uma ferramenta promissora para a detecção precoce do câncer de ovário

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely correlated with a history of articular cartilage damage and ligament avulsion. Surgical animal models of OA of the knee play an important role in understanding the onset and progression of post-traumatic OA and aid in the development of novel therapies for this disease. However, non-surgical models have been recently considered to avoid traumatic inflammation that could affect the evaluation of the intervention. 
In this study, an intra-articular cartilage lesion rat model induced by in vivo cyclic compressive loading was developed, which allowed researchers to (1) determine the optimal magnitude, speed, and duration of load that could cause focal cartilage damage; (2) assess post-traumatic spatiotemporal pathological changes in chondrocyte vitality; and (3) evaluate the histological expression of destructive or protective molecules that are involved in the adaptation and repair mechanisms against joint compressive loads. This report describes the experimental protocol for this novel cartilage lesion in a rat model.

Here, we present the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee, generated by 60 cyclic compressions over 20 N, resulting in damage to the femoral condylar cartilage in rats.

Um Método Não Invasivo para Gerar o Modelo de Lesão da Cartilagem Intra-Articular Induzida por Carga Cíclica do Joelho de Rato

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...