MAL, JCG, e MRS são suportados pela NIA (R00AG033176 e R01AG040081) e pelo Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento Directed, EUA Departamento de contrato de Energia # DE-AC02-05CH11231.

1. Processamento de tecido e Digestão <ol><li> Obtenção de tecido mamário humano como material de descarte de procedimentos cirúrgicos. Mammoplasties de redução pode fornecer células normais ou benignos; fibroadenomas e ginecomastias fornecer células benignas; tecidos não tumorais mastectomia (contralateral ou periférico a um tumor, ou subcutânea) proporcionar células que podem variar de normal benigno para microtumors contenham. Garantir a aprovação do IRB adequada existe antes de obter o material de descarte. Todo o material deve ser tratado segundo pelo sangue regulamentos patógenos. </li><li> Coloque o material em recipientes estéreis contendo tampão ou meios de comunicação (por exemplo, 1:1 Meio Modificado por Dulbecco Eagle e de Ham F-12) suplementado com 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 ug / ml, 5 ug / ml de Fungizone, 50U/ml polimixina B, e 10% de soro fetal bovino, e o transporte para o laboratório, a 4 ° C. Tecido mamoplastia de redução podem ser armazenados ou expedidos a 4 ° C durante 72 horas sem afectar significativamente sua viabilidade celular bsequent. Pequenos pedaços de não-redução do tecido mamoplastia pode exigir um processamento mais rápida. </li><li> Separa-se as áreas epiteliais a partir da matriz de estroma de tecido adiposo, o tecido conjuntivo e os vasos sanguíneos, utilizando uma combinação de escalpelo esterilizado, fórceps e tesouras. Corte pedaços de tecido com uma tesoura e coloque em um prato de vidro esterilizado grande (por exemplo, 150 mm). Suavemente dissecar as áreas epiteliais, que aparecem como fios brancos incorporados na matriz de estroma yellower, utilizando as pinças para segurar o material e o bisturi para raspar o material grosseiramente gordo. Para facilitar a digestão, cortar o tecido epitelial em pedaços mais pequenos de ~ 3-4 mm utilizando bisturis opostos e colocá-las num tubo de ensaio de 50 ml. Se grandes quantidades de tecido estão a ser processados, frescos lâminas de bisturi pode ser necessária. Remover material gorduroso do prato para eliminação de acordo com os regulamentos institucionais. <ol class="lalpha"><li> Em tecidos altamente fibrosos (por exemplo, a injecção subcutânea mastectomies com doença fibrocística grave), não haverá mais sólido branco, material não epiteliais. , Pode ser difícil para dissecar as células epiteliais a partir de matrizes fibrosas tais. Pedaços grandes de material fibroso pode ser cortado em pedaços mais pequenos que sejam ~ 1-3 mm quadrado de área e digerido separadamente. </li></ol></li><li> Colocar o tecido epitelial dissecados para um tubo de centrífuga cónico (50 ml ou 15 ml) com o tecido que compreende não mais do que um terço do volume do tubo. Traga o tubo até ao volume total, deixando apenas um pequeno espaço de ar para permitir a mistura, durante a rotação, através de um tecido de mistura de digestão (DME/F-12 ou equivalente, 10 insulina ug / ml, os antibióticos como acima, e a concentração final de 10 % de FCS, 200 U de colagenase bruta / ml e 100 hialuronidase U / ml. </li><li> Colocar os tubos em um tubo de rotor HulaMixer e rodar de 360 ​​° a 8 rpm durante a noite a 37 ° C. </li><li> Centrifugar os tubos a 600 xg durante 5 min. Descarte a gordura sobrenadante e meio de acordo de eliminaçãoção aos regulamentos institucionais. </li><li> Verifique a conclusão da digestão, diluindo uma pequena alíquota do sedimento em meio. A digestão é completa quando o exame microscópico mostra aglomerados de células (Organóides) com estruturas de aparência suave ductais, alveolar ou ductal-alveolar livre de estroma em anexo (Figura 1A). Tecidos mamoplastia de redução geralmente ainda apresentam estroma anexado após uma digestão durante a noite e vai exigir tempo de digestão adicional. <ol class="lalpha"><li> Ressuspender o sedimento digerido na mistura fresca de tecido de digestão e re-incubar com rotação a 37 ° C durante mais uma hora 4-12. Repita os passos 1.6 e 1.7. Se a digestão é ainda incompleta, novamente adicione a mistura de digestão para o sedimento e re-incubar com rotação a 37 ° C durante a noite. A concentração de enzimas pode ser reduzido para evitar a sobre-digestão durante a noite. </li></ol></li><li> Quando está completa a digestão, centrifugar os tubos a 600 xg durante 5 min, aspirar o digestion mistura, ressuspender o pellet em média, mais antibióticos a cerca de 15 mL/50 tubo ml, 5 ml ml/15 tubo. </li></ol> 2. Filtração e congelação do material digerido <ol><li> Transferir alíquotas de sedimento ressuspenso em um filtro estéril 100 mM ao longo de um tubo estéril de 50 ml. Deixe que a fuga de meio para dentro do tubo, em seguida, lavar novamente os Organóides no topo 1-2x vezes com 2-3 ml de meio. Repetir até que todo o sedimento ressuspenso foi transferido. Se existem demasiados Organóides sobre o filtro e o meio não drena facilmente, utilizar um novo filtro (s) para o restante material. Cuidadosamente virar o filtro (s) em cima de outro tubo estéril e lavar os Organóides para dentro do tubo com mais meio. Este é o 100 piscina organóides jim. </li><li> Levar o material que drenado para dentro do tubo original de 50 ml e repetir o processo de 2,1 utilizando um filtro de 40 | iM, para se obter o 40 piscina organóides um, o qual contém principalmente estruturas alveolares. O material que drenado em thtubo e constitui a piscina filtrado, que contém aglomerados individuais / pequeno de células mesenquimais e epiteliais e pequenos pedaços da vasculatura. </li><li> Pellet os 100 um, 40 um, e piscinas de filtrado a 600 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar a reconstituir, o sobrenadante de cada tubo em CPM II (DME/F-12 ou equivalente com FCS 44% e 6% de DMSO) com cerca de 1 ml de CPMII por 0,1 ml de concentrado de pellet. Manter a 4 ° C. </li><li> Semente de um prato de ensaio para os dois conjuntos de organóides colocando 0,1 ml de material de ressuspenso para a cultura de um tecido gota 35 milímetros prato plástico a gota, como em 3.2 abaixo. O pool de filtrado pode ser directamente semeado em plástico de cultura de tecidos com meio de fibroblastos (DME/F-12 ou equivalente com 10 ug / ml de insulina e 10% de FBS). </li><li> O material restante alíquota ressuspenso em ampolas de congelação Nunc de tipo (1 ml / ampola 2 mL). Congelar durante a noite a -80 ° C e, em seguida, transferir imediatamente para armazenamento em azoto líquido. Não observamos nenhuma perda significativa de viabilidadenas nossas ampolas originais armazenadas congeladas desde o final dos anos 1970. </li></ol> 3. Semeadura Organóides congelados e subcultura de culturas primárias <ol><li> Descongelar rapidamente a ampola congelada contendo os Organóides em um banho de água a 37 ° C. Semente as Organóides em 2 a 10 (geralmente 60 ~ 6) pratos mm, ou 1-3 placas de 100 mm, dependendo da estimativa visual do número de Organóides na ampola. Organóides aproximadamente 20-40 semeados por 60 milímetros prato é o ideal. </li><li> Organóides descongelados são cuidadosamente colocados, gota a gota, para a superfície de prato com uma pipeta de 1 ml ou pipeta de Pasteur para uma distribuição uniforme da Organóides. Organóides colocados próximos um do outro terá um espaço limitado para o crescimento, dando origem a menos células de subcultura ou congelamento. Evite arranhar a superfície do prato (células tendem a não crescer últimos superfícies arranhadas). Espere 1-2 minutos para permitir que os Organóides anexar e, em seguida, adicione lentamente meio de crescimento para evitar o desprendimento de Organóides (por exemplo, 2-3 prato milímetros ml/60). Euncubate a 37 ° C na incubadora de CO 2 humidificado. Estas são as culturas primárias. Atualmente usamos M87A + oxitocina meio (X) para o crescimento mais robusto HMEC (Figura 2). </li><li> Depois de um dia, verifique se os Organóides estão ligados. Adicionar meio adicional (por exemplo, 2-3 milímetros ml/60 prato). Migração de células a partir das Organóides deve ser visível por 24-48 h, e excrescência mitótico por 48-72 horas após a sementeira (Figura 1B, C). Às vezes apego é ruim após 24 horas, principalmente se chapeamento Organóides overdigested ou Organóides de mulheres mais velhas, mas a maioria das preparações irá anexar no prazo de 72 horas. Pequenos pedaços de a vasculatura pode juntar e dar origem a excrescência de células de fibroblasto (Figura 1D). </li><li> Alimente culturas pelo menos 3 vezes por semana. As células cultivadas em meios de comunicação do tipo M87A crescer até à confluência próximo dentro de 5-8 dias, dependendo da densidade de sementeira. </li><li> Se não houver crescimento do fibroblasto significativo, tripsinização Diferencial (DT), com base nadesprendimento rápido de fibroblastos a partir do plástico da superfície, é necessária para remover os fibroblastos. Quando as manchas epiteliais tornam-se grandes, mídia aspirado, prato lavagem (por exemplo, 1-2 ml/60 prato mm) com STE (solução salina, tripsina 0,05%, EDTA 0,02%), aspirado, adicione STE ml fresco 0,5 e deixar em temperatura ambiente por cerca de 1 min com a observação microscópica contínua. Quando os fibroblastos separar as células epiteliais, mas são ainda aderente, suavemente, mas nitidamente pancada do lado do prato de encontro a uma superfície dura, para desalojar os fibroblastos e, em seguida, rapidamente, aspire. Lavar uma vez com PBS, e aspirar de novo. Culturas contaminadas com fibroblastos podem precisar de uma DT adicional. </li><li> Subcultura culturas primárias quando grandes manchas epiteliais estão presentes, mas antes de confluência. A densidade de sementeira e organóides anexo irá influenciar o tempo necessário. Para manter a cultura primária e para gerar múltiplas culturas secundárias, espaçadas ao longo do tempo, realizamos Trypsinizations parciais (PT). </li><li> Mídia Aspirar, lavar um prato 60 mm com 1-2 STE ml, adicionar 0,5 ml STE fresco ao prato. Observar descolamento das células ao microscópio, à temperatura ambiente durante 1-5 minutos, com batidas suaves da placa para promover o descolamento das células. Tripsinização deve ser parada quando aproximadamente 50% das células foram separadas. Precoce PTs têm geralmente descolamento celular rápida. Para mais tarde PTs, as células podem ser colocadas a 37 ° C durante mais rápido desprendimento, com monitorização cuidadosa, já que todas as células podem soltar-se rapidamente. </li><li> Adicionar 2 ml de meio contendo soro para o prato, repipette para lavar, e transferir para um tubo estéril de 15 ml. Repita 2x com outros ~ 1-2 ml de meio, adicionar a solução de lavagem para o tubo. Refeed o prato principal e voltar a incubadora. Contar as células no tubo com o hemocitómetro. PTs pode ser repetido cerca de 4 a 8 vezes com recrescimento de células bem nos pratos principais e crescimento a longo prazo dos componentes secundários equivalente subcultivados ou congeladas (células segunda passagem são chamados secundários, uma vez subcultivadas, as células não são eisprimárias NGER). Uma vez que o material organóides já não está presente nas culturas primárias, secundárias subcultivados mostram um declínio no potencial de longo prazo de duplicação da população. </li><li><ol class="lalpha"><li> Para subcultura de componentes secundários, as células de semente directamente a partir do tubo dentro de pratos. Sementeira de 1-2 x 10 mm 5 células/100 prato em meio sólido tal como M87A + X irá conduzir a confluência em 4-7 dias. Acrescentamos toxina da cólera ao meio em segunda passagem para aumentar o potencial proliferativo; toxina da cólera é omitida em cultura primária porque conduz a excrescência de células de várias camadas a partir dos Organóides. </li><li> Para a congelação como secundárias, pellet tubo a 600 xg durante 5 min, e ressuspender em CPMII com uma densidade final de 10 6 células / ml. Alíquota células ressuspensas em ampolas de congelação Nunc de tipo, congelar durante a noite a -80 ° C e, em seguida, transferir imediatamente para armazenamento em azoto líquido. </li></ol></li><li> Recomenda-se para congelar as células a partir da primeira para a guarda PT, eutilizar células do PT segunda subcultura. PTs adicional pode ser armazenado congelado para uso futuro. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método de processamento de tecido mamário humano aqui apresentada permite a obtenção de células epiteliais mamárias puros da mistura heterogénea de tipos de células no coração humano. A filtração através de poros de tamanho fixo, permite a separação de diferentes fracções de glândula mamária (por exemplo, ductal e ductal-alveolar vs alveolar) a partir da matriz estromal digerido. Isogénicas fibroblastos mamarias podem ser obtidas para coincidir com as células epiteliais. Material digerido congelado manteve viabilidade bom por mais de 30 anos. Este método tem trabalhado com sucesso em todos os mas muito fibrosos tecidos mamários, e é simples de executar. Outras variações de processamento de tecido mamário que existem não fornecem fracções epiteliais que são tão viáveis, limpo, ou separados. Colocação de Organóides processados ​​em cultura com baixas indutoras de stress mídia, como M87A permite crescimento de longo prazo de HMEC com marcadores de linhagem múltiplos. HMEC que foram cultivadas em plástico ainda mantêm a capacidade de géneroste estruturas 3D com normal em relacionamentos vivo-como linhagem. Estas culturas HMEC são adequados para investigação experimental extenso, incluindo produção elevada, de comportamento normal e HMEC fatores que podem impulsionar ou inibir a senescência e transformação.

<table border="1"><tbody><tr><td> Vidro de Petri 15 centímetros </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Scissors 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Fórceps 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Bisturis descartáveis </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin estreptomicina / </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Life Technologies </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polimixina B sulfato </td><td> Life Technologies </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Life Technologies</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> Tripsina 0,05% 100 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Life Technologies </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Life Technologies </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Célula de 100 um filtro </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> 40 um coador de células </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Tubos de 15 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Tubos de 50 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> Pratos TC 10 centímetros </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> Pratos de CT 6 centímetros </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Frascos criogênicos </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser Científico </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Eppendorf modelo </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture

Exame experimental de comportamento epitelial humana normal das células mamárias (HMEC), e como normal, as células adquirem propriedades anormais, pode ser facilitada por sistemas de cultura in vitro, que maior precisão do modelo em biologia vivo. A utilização de material derivado humano para estudar a diferenciação celular, envelhecimento, senescência, e imortalização é particularmente vantajosa tendo em conta as muitas diferenças significativas moleculares nestas propriedades entre as células humanas e de roedores comumente utilizado 1-2. Células mamárias apresentam um sistema modelo conveniente, porque grandes quantidades de tecidos normais e anormais estão disponíveis devido à freqüência da mamoplastia redutora e cirurgias de mastectomia. A glândula mamária consiste de uma mistura complexa de muitos tipos de células diferentes, por exemplo, tecido adiposo, epitelial, mesenquimal, endoteliais. As células epiteliais são responsáveis ​​pela função diferenciada mamária de lactação,e são também a origem da grande maioria dos cancros da mama humanos. Nós desenvolvemos métodos para processar tecidos de glândula mamária de descarte cirúrgicos em puros componentes epiteliais, bem como células mesenquimais 3. O material processado pode ser armazenado congelado indefinidamente, ou iniciados em cultura primária. O material de descarte cirúrgico é transportado para o laboratório e manualmente dissecado para enriquecer para o tecido epitelial contendo. Digestão posterior do tecido dissecado usando colagenase e hialuronidase tiras de material a partir do epitélio do estroma na membrana basal. Os pedaços resultantes pequenas da árvore epitelial (Organóides) pode ser separado a partir do estroma digerido por filtração sequencial sobre membranas de dimensão de poro fixa. Dependendo do tamanho do poro, podem ser obtidas fracções consistindo em maiores ductais / alveolar peças, aglomerados menores alveolar, ou células do estroma. Temos observado crescimento superior quando as culturas são iniciadas como Organóides em vez de dissociada células individuais. Colocação de Organóides na cultura usando a mídia de baixo estresse indutores suporta crescimento de longo prazo de HMEC normal com marcadores de linhagem tipos múltiplos (mioepiteliais, progenitor, luminal) 4-5. Um número suficiente de células podem ser obtidas a partir de tecido de um indivíduo para permitir o exame experimental extenso usando lotes de células padronizados, bem como o uso de interrogação modalidades de elevada capacidade. HMEC cultivadas têm sido empregues numa vasta variedade de estudos que examinam os processos normais que regulam o crescimento, diferenciação, o envelhecimento, e senescência, e como estes processos normais são alteradas durante a transformação maligna e imortal 4-15,16. Os efeitos do crescimento na presença de material de matriz extracelular, outros tipos de células, e / ou a cultura em 3D pode ser comparado com o crescimento em 5,15 plástico. HMEC cultivadas, a partir de células normais, fornecer um sistema experimental para examinar os factores tratável quepode impulsionar ou prevenir o envelhecimento humano e carcinogênese.

Valores representativos para tecidos adequadamente digeridas para Organóides e colocados em cultura são mostrados na Figura 1. Tecido digerido irá mostrar o material ainda está ligado para o exterior destas estruturas, e é provável que tenha algum crescimento de células fibroblásticas em cultura primária, necessitando de DT para remover. Tecido Overdigested vai mostrar menos suaves fronteiras externas, e pode levar mais tempo para anexar em cultura primária. Outgrowth epitelial deve começar dentro de 48-72 h (1B, C). Pequenos pedaços de vascularização (1D) pode ser uma fonte de crescimento de células mesenquimais. Outgrowths epiteliais mostrar populações morfologicamente heterogéneas, com populações proliferativas que contêm misturas de células com marcadores associados com a progenitora, mioepiteliais, e linhagens luminais (1E, 3C-E). Crescimento em meios de baixa tensão, como M87A suplementadas com toxina da cólera e ocitocina vai apoiar superior a longo prazocrescimento do normal pré-estase HMEC em comparação com as formulações anteriores de media (Figura 2). M87A tipo media também irá suportar o crescimento de células luminais e progenitoras através de passagens 4-8 (Figuras 3C-E, 4), depois disso, a maioria dos marcadores de linhagem de células mostram apenas mioepiteliais. HMEC cultivadas em plástico podem conservar a sua capacidade de formar 3D adequada da auto-organização em micropatterned 3D micropoços, com células luminais interior de células mioepiteliais (Figura 4A, B), e de modo a formar estruturas organizadas, quando plaqueadas em Matrigel (4C, D). <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Organóides HMEC e cultura primária. (A) organóides mostrando ductal-alveolar estrutura após a digestão e filtração. (B, C) que mostra a estrutura Organóides ductal e alveolar de 2 dias após a colocação em cultura primária; observe a célula inicial outgrowth (setas brancas). (D) pequeno vaso sanguíneo ligado e com o início de crescimento de fibroblastos de culturas mesmas B, C. (E) excrescência de células epiteliais de cultura primária organóides após 4 dias. Linhagens são identificados por coloração com anticorpos anti-K14 (vermelho) e K19 (verde); núcleos foram coradas com DAPI (azul). Luminal (K14-/K19 +, verde), mioepitelial (K14 + /-K19, vermelho), e progenitor (K14 + / + K19, amarelo), as células são visíveis. As células não coradas são observados no núcleo organóides devido à penetração de anticorpos incompletos. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Crescimento das culturas HMEC em diferentes formulações de mídia. Organóides obtidos de um indivíduo, a amostra 184, foram iniciados na cultura principal, utilizando diferentes formulações de mídia. Melhor crescimento a longo prazo, é obtido utilizando a nossa formulação mais recente, M87A + oxitocina (X) 4. Este meio também suportacrescimento de várias linhagens de HMEC (ver fig. 1E). Uma formulação de meios anteriormente, MM 3 fornecida crescimento menos robusto, enquanto que um meio isento de soro, MCDB170 (MEGM comercial) 17 leva a indução rápida da ciclina quinase p16 inibidor INK4a e selecção para as células aberrantes 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Figura 3. Comparação da diversidade na linhagem Organóides incultas e HMEC cultivadas a 4 ª passagem análise FACS. (A, B) de um organóides, uncultured dissociado enzimaticamente para a expressão (A) de EpCAM e 6 CD49f/alpha integrina, e (B) CD227/Muc1 e CD10/CALLA. (C, D) A análise FACS de 4 de passagem pré-estase HMEC para a expressão de (C) e EpCAM CD49f/alpha 6 integrina, e (D) e CD227/Muc1 CD10/CALLA. P identificávelopulations são rotulados como LEP (expressando luminal marcadores EpCAM ou CD227), MEP (expressando marcadores mioepiteliais CD49f ou CD10), ou PROG (enriquecido no CD49f + / EpCAM população +). Note-se que, durante a adaptação a regulação cultura de mudanças EpCAM e CD49f comparação com Organóides não cultivados. (E) Unsorted HMEC e FACS enriquecido LEP e MEP a 4 ª passagem corados para análise de imunofluorescência de queratina K14 (MEP marcador) e K19 (LEP marcador) para verificar a identificação linhagem. Manchado núcleos com DAPI aparecem em azul. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Figura 4. HMEC cultivadas são capazes de formar estruturas organizadas com relações em in vivo como linhagem quando colocados em microambientes apropriados. (A) pré-estase 4 ª passagem HMEC foram FACS enriquecido into luminal LEP e linhagens de MEP mioepiteliais, utilizando marcadores para CD227 e CD10, com estas linhagens verificada por expressão de K14 e K19 (não mostrado). (B) Quando misturados em micropatterned micropoços, as células cultivadas são capazes de auto-organização em bicamadas com MEP na parte externa e interna da LEP [adaptado de Chanson et al. 5]. LEP marcado por fluorescência (verde) e MEP (vermelho) foram fotografadas com um microscópio confocal de 0 h, 24 h, e 48 h após a adição ao micropoços (superior). Controle HMEC foram arbitrariamente rotulados com etiquetas vermelhas ou verdes fluorescentes (mais baixa). (C) imagem de campo brilhante de células progenitoras enriquecidas com FACS (c-kit +) plaqueadas em 3D de cultura (Matrigel) e cultivadas durante 18 dias. Estruturas resultantes podem exibir morfogênese alveolar. (D) As estruturas foram extraídos de Matrigel e coradas para detectar K14 e K19; núcleos foram contrastadas com DAPI. Análise de imunofluorescência mostra estruturas organizadas com pola luminal e basal corretorança.

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Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Um método para processar o material de descarte mamária humana cirúrgico é descrito. Tecido transformado, sob a forma de Organóides, podem ser armazenadas congeladas indefinidamente ou colocadas em cultura para crescimento a longo prazo. Este método permite a análise experimental da biologia celular epitelial humana normal, e os efeitos das perturbações exógenas.

Processamento da mamoplastia redutora e tecidos humanos Mastectomia para cultura de células

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K visualizações.  Lawrence Berkeley National Laboratory. Um método para processar o material de descarte mamária humana cirúrgico é descrito. Tecido transformado, sob a forma de Organóides, podem ser armazenadas congeladas indefinidamente ou colocadas em cultura para crescimento a longo prazo. Este método permite a análise experimental da biologia celular epitelial humana normal, e os efeitos das perturbações exógenas.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Medicina

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

Isolamento, cultura, e imagem de Fetal Humano pancreáticas grupos de células

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Cultura primária de Vestibular Humano Schwanomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Dupuytren Humano do<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para o Estudo da Miofibroblastos e Matriz Extracelular Interações

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Trabalhando com tecidos humanos para Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

Um modelo de cultura de fatia organotipica de glioblastoma humano para estudo de migração de células tumorais e efeitos específicos de pacientes de drogas anti-invasivas

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensional Cultura alginato-talão de células humanas adenoma pituitário

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodologia para a indução de escarro e laboratório de processamento

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...