Este trabalho foi financiado por doações do Fritz Thyssen Foundation (10.11.2.153 a RK), o alemão Conselho de Pesquisa (DFG, KR2119/3-2 e KR2119/8-1 a RK), o Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 a RK) e por uma bolsa de doutoramento da Fundação de caridade Hertie [para LFB]. Agradecemos Carolin Obermaier e Julia Westermeier por seu apoio durante a filmagem do vídeo.

1. A biópsia de pele e cultura de fibroblastos humanos <ol><li> A biópsia de pele tem de ser tomada por um médico experiente. O procedimento é realizado sob condições estéreis e requer anestesia local. Sítios típicos usados ​​para a biópsia é o lado interno da parte superior do braço, ombro ou costas. </li><li> Você pode tirar amostras de diâmetro 4x4mm ou 6x6mm por biópsia para obter tecido suficiente para fibroblastos humanos cultura. </li><li> Cortar a biópsia da pele em pequenos pedaços iguais em condições estéreis para separá-los em frascos T25 2-4. Cada frasco deve conter 2-3 pedaços de epiderme. O meio de cultura contém FCS a 15%, piruvato de sódio a 1,1% e 1% de penicilina / estreptomicina no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640. </li><li> Incubar as células a 37 ° C e 5% CO 2. O tempo de propagação esperado até fibroblastos primeiro crescer para fora da amostra da epiderme é de 1-2 semanas. Se os problemas de crescimento são encontrados, você pode fazer uso de fa de crescimento de fibroblastosctor (5-10 ng / ml FGF2), para aumentar o crescimento das células. </li><li> Uma vez que uma célula de confluência de 50-70% é alcançado, os fibroblastos humanos primários pode ser congelada. O tempo até a confluência de 50-70% é alcançado, difere entre as linhagens de células. Congelar os fibroblastos em 90% de FCS a 10%, mais de sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li></ol> 2. Preparação de fibroblastos humanos para Microscopia de células vivas de imagem Em geral, as experiências com fibroblastos humanos deve ser realizada com menos de 10 passagens como senescência associadas alterações podem alterar as propriedades das células após múltiplas passagens. Em caso de dúvida, a beta-galactosidase ensaios podem ser usados ​​para avaliar a indução de processos de envelhecimento nas respectivas células. Geralmente, não usar fibroblastos envelhecidos (ver acima). Além disso, para comparar diversas linhagens, trabalhar com o número mesma passagem de cada linha de células. Comparação de diferentes pacientes geneticamente homogéneos em comparação com controlos saudáveis ​​é recomendada. No entanto, como algumas vezespacientes portadores de mutações específicas podem ser raros, isso pode significar que as biópsias de pele de apenas um paciente com um número de certa passagem e linhas de controle diferentes têm de ser incluídos - aqui é essencial para garantir o número mesma passagem de todas as linhas incluídas. Se uma célula de confluência de 50-70%, mas não é atingida experiência projectada, fibroblastos devem ser congeladas. <ol><li> No primeiro dia do experimento, os fibroblastos em anexo lavar uma vez com PBS. Depois libertá-los a partir do frasco de fundo por meio de uma solução desprendimento de células de enzimas proteolíticas (por exemplo, ADNase ACCUMAX). </li><li> Contar as células e as sementes de 50,000-70,000 células em cada poço de uma lamela 4 câmaras (1,8 centímetros área de cultivo 2 por poço). Por conseguinte, para os coverglas 8-câmara, a metade do número de células ou um pouco menos apropriado (0,8 centímetros área de cultivo 2 por poço). É importante para as sementes, em vez de um pequeno número de células para realizar a análise de uma única célula real. Nenhum revestimento específico para as câmaras is necessário. </li><li> Após 24-48 horas, a experiência de imagem ao vivo das células pode ser executada. Certifique-se de que o microscópio de imagem ao vivo célula está equipada com uma incubadora que controla a temperatura e os níveis de CO 2. Durante a aquisição de imagem, numa atmosfera de 37 ° C e 5% CO 2 deve ser mantida. </li><li> Cada medição de imagens ao vivo de células deve ser efectuada em, pelo menos, três experiências independentes. No total, a um mínimo de 50 células por linha de células deve ser trabalhada. As experiências com células vivas de imagem, bem como as análises off-line tem que ser realizada sob condições cegas para garantir dados imparciais recolha. </li></ol> 3. Medição da função mitocondrial em Viver fibroblastos humanos Para a medição convencional da função mitocondrial via potencial de membrana mitocondrial (MMP) dependentes de corantes, classificação de células activadas fluorescentes (FACS) é o método primário. No caso de fibroblastos humanos, celular autofluorescence é frequentemente observada e pode causar resultados falsos positivos por interferência com o sinal de coloração real. Autofluorescência tipicamente se torna mais pronunciada com um maior número de passagem de fibroblastos. Portanto, prefere-se avaliar a função mitocôndrica de fibroblastos humanos por meio de microscopia de imagem de células vivas. <ol><li> 24-48 horas após a sementeira, incubar os fibroblastos em 50 nM de MMP-dependente tetramethylrodamine corante éster etílico (TMRE) em meio RPMI. Este meio RPMI falte vermelho de fenol como isso pode afetar negativamente a qualidade da imagem. 1,6 uM de coloração Hoechst deve ser adicionado para visualizar os núcleos. </li><li> Incubar as células em solução de coloração preparado protegida da luz durante 15 min a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Substituir a solução de coloração com meio RPMI (sem vermelho de fenol). Prosseguir sem um passo de lavagem e as células imediatamente de imagem. Usar a ampliação 63x e confocal a laser técnica de microscopia de varredura (microscopia de fluorescência usando alternativamenteApoTome técnica) para definir camadas únicas de células. Aplicar 37 ° C e 5% de CO 2 para as células durante o processo de criação de imagens. </li><li> Quando as imagens fibroblastos, prestar a máxima atenção ao tempo de exposição aplicado de luz fluorescente como coloração TMRE pode descorar rapidamente. Defina o seu tempo de exposição adequado entre 200 e 300 ms e não exceder este intervalo. A aquisição das imagens nas configurações padronizadas é muito importante, pois um não seria capaz de fazer comparações com base na intensidade se as configurações são diferentes entre as linhas celulares. </li><li> Como um raio definido em torno das células é branqueada com imagem após a exposição à luz, mantenha o próximo campo visuais adequadamente distante da secção de Foto-descoloração. </li><li> Off-line análises são realizadas utilizando Software ImageJ (Wayne Rasband; Institutos Nacionais de Saúde, EUA). </li><li> Selecione seu celular de interesse, usando uma ferramenta de seleção. </li><li> Converter a imagem para 8 bits (Imagem &lt;Tipo &lt;8 bits). </li><li> B reduzir o ruído inespecíficosy usando a função &quot;despeckle&quot; (Processo &lt;Ruído &lt;despeckle). </li><li> Escolha a opção &quot;tabelas de pesquisa - Fire&quot; condição (Imagem &lt;tabelas de pesquisa de Fogo &lt;). </li><li> Mude na função limite para o &quot;Acima / Abaixo&quot; função e ajustar limiar (Imagem &lt;Ajuste Limiar &lt;). </li><li> Selecione a opção &quot;analisar partículas opção&quot;, o que lhe dará o valor médio de cinza para cada partícula mitocondrial detectáveis ​​(Analise &lt;analisar partículas). Salvar a lista de resultado dado como uma planilha do Excel. </li><li> Arquivo de resultado aberto no programa Excel e calcular a média do valor médio cinza das estruturas mitocondriais (indicado como &quot;médio&quot; na lista dada resultado excel). </li><li> Para criar um gráfico de superfície, escolha o plugin &quot;plotagem de superfície 3D interativo&quot; na seção plugin &quot;3D&quot;. Aqui, você pode ajustar ainda mais a trama usando diferentes opções de exibição. Alterar as &quot;cores originais&quot; para &quot;Spectrum LUT&quot; dá a barra de escala de intensidade para o enredo apropriado. </li><li> Alternativamentepara usar TMRE para analisar a função mitocondrial de fibroblastos humanos por meio de imagens de células vivas, de uma combinação de a MMP-dye independente Mitotracker Verde FM ea Mitotracker MMP-dependente corante CM-H 2 Xros pode ser usado. Mais uma vez, para fibroblastos humanos vivem microscopia imagens de células é a preferida, mas, em geral, esta alternativa tem sido também utilizado por análise FACS em outro tipo de células 12. Ao usar esse método alternativo para medir a função mitocondrial em fibroblastos humanos, passo 3-7 da seção de protocolo 5 &quot;Medição de mitochondrio-lisossomal co-localização em viver fibroblastos humanos&quot; deve ser aplicada. Com isso, a sobreposição dos sinais, tanto de positivo mitocôndria para Mitotracker Verde FM e CM-H 2 Mitotracker Xros é calculada e indica a quantidade de mitocôndria funcional como razão a todos os presentes mitocôndrias. </li></ol> 4. Medição de Morfologia mitocondrial em Viver fibroblastos humanos <ol><li> 24-48hr após a sementeira, as células a incubar em 200 nM Mitotracker Verde FM em meio RPMI (sem vermelho de fenol), protegida da luz durante 15 min a 37 ° C e 5% CO 2. 1,6 uM de coloração Hoechst deve ser usada para destacar núcleos. Mitotracker Verde FM é um corante MMP-independente, que mancha todas as estruturas mitocondriais apresentar. </li><li> Lavar suavemente as células uma vez com PBS. </li><li> Adicionar meio RPMI fresco (sem vermelho de fenol), de células e de células imediatamente de imagem. Use ampliação 63x e microscopia confocal a laser técnica de varrimento (microscopia de fluorescência utilizando a técnica alternativa ApoTome) para definir camadas únicas de células. </li><li> Off-line análises são retirados com o uso de software ImageJ. </li><li> Selecione seu celular de interesse, usando uma ferramenta de seleção. </li><li> Converter a imagem para 8 bits (Imagem &lt;Tipo &lt;8 bits). </li><li> Reduzir o ruído inespecíficos usando o &quot;despeckle&quot; função (Processo Ruído &lt;&lt;despeckle). </li><li> Use o filtro de convolução para destacar mitocôndriasestruturas mitocondrial (PROCESSO &lt;Filtros &lt;Convolve). </li><li> Ajustar o limite de modo a que a relação sinal-para-ruído é apropriado (Image &lt;Ajuste Threshold &lt;). </li><li> Usando a &quot;analisar partículas&quot; opção, a identificação automática de estruturas mitocondriais é iniciada com base em um tamanho de pixel escolhido (Analisar &lt;analisar partículas). Vários parâmetros mitocondriais são posteriormente calculada como a área, perímetro, eixos menor e maior ou circularidade. Estas medidas podem ser ajustados individualmente (análise de medidas &lt;SET). Salvar a lista de resultado dado como uma planilha do Excel. </li><li> Abra o arquivo resultado no programa Excel. Com o uso de tais parâmetros, as análises da morfologia mitocondrial pode ser realizada. Isto inclui a definição do factor de forma que indica o grau de ramificação de uma rede mitocondrial [fórmula: (perímetro 2) / (4 * PI () * area)], bem como a relação de aspecto que define o comprimento da fórmula (mitocôndrias: major eixos / eixos menores). </li></ol> 5. Medição da Mitochondrio-lisossomal em colocalização estar Fibroblastos Humanos <ol><li> 24-48 horas após a sementeira, as células a incubar em 200 nM Mitotracker Verde FM e 100 nM Lyostracker Red DND-99 em meio RPMI (sem vermelho de fenol), protegida da luz durante 15 min a 37 ° C e 5% CO 2. 1,6 mM de coloração Hoechst é usado para destacar núcleos. </li><li> Substituir o meio com meio RPMI fresco (sem vermelho de fenol) contendo 100 nM Lyostracker Red DND-99. Este corante tem de estar presente durante a sessão de imagem inteira. Não lave as células após o período de incubação. Imediatamente imagem das células. Use ampliação 63x e técnica confocal (técnica alternativa ApoTome) para definir camadas únicas de células. </li><li> Off-line análises são retirados com o uso de software ImageJ. </li><li> Abra as duas respectivas imagens que você gostaria de analisar em termos de estatuto co-localização. </li><li> Converter a imagem para 8 bits (Imagem &lt;Tipo &lt;8 bits). </li&gt; <li> Reduzir o ruído inespecíficos usando a função &quot;despeckle&quot; em ambas as imagens (Processo &lt;Ruído &lt;despeckle). </li><li> Escolha o plugin &quot;Jacop&quot; como ferramenta de co-localização análise, o que lhe dá valores para os respectivos canais e calcula o coeficiente de Pearson, coeficiente de sobreposição e coeficiente Manders (Plugins &lt;Jacop). </li></ol> 6. Resultados representativos Função mitocondrial em viver fibroblastos humanos pode ser avaliada através da técnica ao vivo célula de imagem. Para os ensaios funcionais, o sinal de fluorescência TMRE se correlaciona com o potencial de membrana mitocondrial (MMP). Sob condições normais de MMP, a fluorescência TMRE é significativamente mais elevada (Figura 1A, fila superior) do que em condições patológicas caracterizadas por um MMP reduzida (Figura 1A, linha inferior). Esta intensidade de fluorescência é medida através do cálculo da média do valor médio de cinzento de cada estrutura mitocondrial ( <strong&gt; Figura 1B). A intensidade de fluorescência pode ser medida por meio de software ImageJ. Aqui, o uso da opção &quot;trama superfície interactiva&quot; permite a ilustração de diferentes intensidades de pico (figura 1A, direita). Junto à avaliação da função mitocondrial em fibroblastos humanos, a microscopia de imagem de células vivas pode ser utilizado para definir os diferentes parâmetros da morfologia mitocondrial. Ao utilizar o Mitotracker estruturas verdes FM corantes mitocondriais são visualizados independentemente da sua respectiva MMP (Figura 2). Isso é importante para garantir a inclusão de todas as estruturas mitocondriais presentes nas análises. Usando ImageJ Software, a morfologia é analisada com base nas figuras binárias, uma vez que apenas os parâmetros morfológicos aqui mitocondriais podem ser avaliadas (Figura 2, &quot;binário&quot;). Exemplos para análise da morfologia mitocondrial, em termos de factor de forma, bem como relação de aspecto foram publicados recentemente 6, 13. Uma outra característica importante que pode ser medido em fibroblastos humanos vivos é a degradação das estruturas mitocondriais. O primeiro passo neste progresso pode ser avaliada por mitochondrio-lisossomal colocalização em microscopia vivo de células de imagem. Determinados estados patológicos resultantes de uma co-localização de mitocôndria aumentou com os lisossomas (Figura 3A). Novamente, Mitotracker Verde FM é usado para corar as estruturas mitocondriais, independentemente da sua respectiva MMP. Além disso, a coloração com Lyso Tracker red DND-99 permite visualizar estruturas lisossomais. É fundamental que o corante Vermelho Lyso Tracker está presente durante o processo de criação de imagens, como etapas de lavagem reduzem o sinal que se torna demasiado baixo para visualização. Colocalização é representado por claros sinais de fluorescência amarela devido à sobreposição de o verde (verde Mitotracker FM) e vermelho (Lyso Tracker red DND-99) de coloração (setas brancas, Figura 3A) e são determinados por cálculo do coe Pearsonfficient (Figura 3B). Em geral, para fora da linha de análises com software ImageJ, é útil para visualizar uma célula por imagem, de modo que a definição de uma região específica de interesse (ROI) possam ser evitadas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig1.jpg" /> Figura 1. Medição do sinal de fluorescência TMRE indicando o potencial de membrana mitocondrial (MMP), em fibroblastos humanos vivos, pela técnica de imagem ao vivo de células. (A) é um corante TMRE MMP-dependente fluorescente, cuja intensidade de fluorescência se correlaciona com a MMP. Corante Hoechst foi utilizado para corar núcleos (azul). Sob condições normais de MMP (linha de cima), a fluorescência TMRE é significativamente maior do que em condições patológicas caracterizadas por um MMP reduzida (linha de baixo). A intensidade da fluorescência é adicionalmente mostradacomo plotagem de superfície intensidade. Barra de escala indica 10 um. (B) A análise estatística dos fibroblastos exemplar mostrado em (A). Em condições patológicas, uma fluorescência TMRE diminuição das mitocôndrias é medido em relação à condição MMP normal. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig2.jpg" /> Figura 2. Medição da morfologia mitocondrial em fibroblastos humanos vivos, pela técnica de imagem ao vivo de células. Mitotracker Verde FM (verde) é usado para visualizar estruturas mitocondriais, para que ele é independente da MMP. Corante Hoechst foi utilizado para corar núcleos (azul). Usando Software ImageJ, a morfologia pode ser analisado em números binários. Barra de escala indica 10 m. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4228/4228fig2large.jpg" target="_blank">Clique</a><html> aqui para ver maior figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4228/4228fig3.jpg" /> Figura 3. Medição da co-localização de mitocôndrias com lisossomas em fibroblastos humanos vivos, pela técnica de imagem ao vivo de células. (A) Mitotracker Verde FM (verde) é usado para corar as estruturas mitocondriais, Lyostracker Red DND-99 (vermelho) visualiza estruturas lisossomais. Corante Hoechst foi utilizado para corar núcleos (azul). Colocalização bem sucedida sob as condições patológicas é indicado por um sinal de amarelo devido à sobreposição de Red Lyso Tracker e coloração Mitotracker Green (setas brancas). Barra de escala indica 10 um. (B) A análise estatística dos fibroblastos exemplar mostrado em (A). Um maior grau de resultados mitochondrio-lisossomais colocalização de um valor elevado coeficiente de Pearson./ 4228/4228fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Fibroblastos da pele do paciente como modelos ex vivo representam uma ferramenta importante para caracterizar a doença associadas defeitos genéticos. Além disso, a pele derivados de fibroblastos são facilmente acessíveis e podem ser expandidos a cultura. Portanto, as células primárias obtidas a partir de pacientes portadores de PD-associadas mutações genéticas são preferíveis durante a utilização de linhas de células de tumor uma vez que contêm não só o gene causador de doença endógena, mas ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Não Catálogo. </td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 52400-025 </td></tr><tr><td> Meio RPMI 1640, sem vermelho de fenol </td><td> Invitrogen </td><td> 11835-063 </td></tr><tr><td> Dulbecco tamponada com fosfato (DPBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> Fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) </td><td> PeproTech </td><td> 100-18B </td></tr><tr><td> ACCUMAX (solução desapego) </td><td> PAA </td><td> L11-008 </td></tr><tr><td> Lab-TekTMII esfregaços chambered </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 115382 </td></tr><tr><td> Tetramethylrodamine éster etílico (TMRE) </td><td> Invitrogen </td><td> T-669 </td></tr><tr><td> Mitotracker Verde FM </td><td> Invitrogen </td><td> M-7514 </td></tr><tr><td> Mitotracker CM-H2XRos </td><td> Invitrogen </td><td> M-7513 </td></tr><tr><td> Lyostracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L-7528 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H-3570 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes específicos e de equipamento.

the use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of parkinson's disease

A doença de Parkinson (DP) é o distúrbio de movimento segundo mais comum e afeta 1% das pessoas com idade superior a 60 1. Porque o envelhecimento é o fator de risco mais importante, os casos de PD irá aumentar durante as próximas décadas 2. Ao lado de dobramento de proteínas patológica e vias de degradação de proteínas com deficiência, alterações da função mitocondrial e morfologia foram apontados como característica adicional de neurodegeneração na DP 3-11. Depois de anos de pesquisa em células de cancro de murídeo e humanos como em modelos in vitro, para dissecar vias moleculares do parkinsonismo, a utilização de fibroblastos humanos a partir de doentes e os controlos adequados como modelos ex vivo tornou-se uma ferramenta de investigação valiosa, se ressalvas potenciais são considerados. Outros que imortalizaram, modelos de células bastante artificial, fibroblastos primários de pacientes portadores de doença mutações associadas aparentemente refletem importantes características patológicas of a doença humana. Aqui nós delinear o processo de realização das biópsias da pele, f ibroblastos humanos de cultura e meio de protocolos detalhados para técnicas microscópicas essenciais para definir fenótipos mitocondriais. Estas foram utilizadas para investigar as diferentes características associadas à DP que são relevantes para a função mitocondrial e dinâmica. Ex vivo, as mitocôndrias podem ser analisados ​​em termos da sua função, morfologia, colocalização com lisossomas (os organelos degradante mitocôndrias disfuncionais) e através da via de degradação lisossómica . Estes fenótipos são muito relevantes para a identificação de sinais precoces de PD e pode preceder os sintomas motores da doença clínica em humanos do gene-transportadoras. Assim, os ensaios aqui apresentados podem ser utilizados como ferramentas valiosas para identificar as características patológicas da neurodegeneração e ajudar a definir novas estratégias terapêuticas na doença de Parkinson.

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The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblastos de pacientes portadores de mutações no causadores de doenças de Parkinson genes representam um facilmente acessível<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar doenças associadas fenótipos. Imagens de células vivas dá a oportunidade de estudar os parâmetros morfológicos e funcionais nas células vivas. Aqui, descrevemos a preparação de fibroblastos humanos e monitorização subsequente de fenótipos mitocondriais.

A utilização de recursos primários fibroblastos humanos de Monitoramento Fenótipos mitocondriais no Campo da Doença de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

16.7K visualizações.  DZNE. Fibroblastos de pacientes portadores de mutações no causadores de doenças de Parkinson genes representam um facilmente acessível Ex vivo Modelo para estudar doenças associadas fenótipos. Imagens de células vivas dá a oportunidade de estudar os parâmetros morfológicos e funcionais nas células vivas. Aqui, descrevemos a preparação de fibroblastos humanos e monitorização subsequente de fenótipos mitocondriais.

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Geração Experimental de Carcinoma Associado fibroblastos (FAC) de Fibroblastos Humanos mamária

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Medicina

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our understanding of the mechanisms underlying parkinsonian symptoms, since it recapitulates the changes in basal ganglia circuitry and pharmacology observed in parkinsonian patients1-4. However, the precise cellular and molecular changes occurring at cortico-striatal synapses of the output pathways within the striatum, which is the major input region of the basal ganglia remain elusive, and this is believed to be site where pathological abnormalities underlying parkinsonian symptoms arise3,5.
In PD, understanding the mechanisms underlying changes in basal ganglia circuitry following degeneration of the nigro-striatal pathway has been greatly advanced by the development of bacterial artificial chromosome (BAC) mice over-expressing green fluorescent proteins driven by promoters specific for the two striatal output pathways (direct pathway: eGFP-D1; indirect pathway: eGFP-D2 and eGFP-A2a)8, allowing them to be studied in isolation. For example, recent studies have suggested that there are pathological changes in synaptic plasticity in parkinsonian mice9,10. However, these studies utilised juvenile mice and acute models of parkinsonism. It is unclear whether the changes described in adult rats with stable 6-OHDA lesions also occur in these models. Other groups have attempted to generate a stable unilaterally-lesioned 6-OHDA adult mouse model of PD by lesioning the medial forebrain bundle (MFB), unfortunately, the mortality rate in this study was extremely high, with only 14% surviving the surgery for 21 days or longer11. More recent studies have generated intra-nigral lesions with both a low mortality rate &gt;80% loss of dopaminergic neurons, however expression of L-DOPA induced dyskinesia11,12,13,14 was variable in these studies. Another well established mouse model of PD is the MPTP-lesioned mouse15. Whilst this model has proven useful in the assessment of potential neuroprotective agents16, it is less suitable for understanding mechanisms underlying symptoms of PD, as this model often fails to induce motor deficits, and shows a wide variability in the extent of lesion17, 18.
Here we have developed a stable unilateral 6-OHDA-lesioned mouse model of PD by direct administration of 6-OHDA into the MFB, which consistently causes &gt;95% loss of striatal dopamine (as measured by HPLC), as well as producing the behavioural imbalances observed in the well characterised unilateral 6-OHDA-lesioned rat model of PD. This newly developed mouse model of PD will prove a valuable tool in understanding the mechanisms underlying generation of parkinsonian symptoms.

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson&#039;s Disease

A protocol for performing unilateral 6-OHDA lesions of the medial forebrain bundle in mice is described. This method has a low mortality rate (13.3 %) with 89% of the surviving animals showing &#62;95% loss of striatal dopamine and 90.63&#177;-4.02 % ipsiversive rotational bias towards the side of the lesion.

Desenvolvimento de um Unilateralmente-lesionadas modelo de rato 6-OHDA da Doença de Parkinson

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

Espectrometria de Massa MALDI imagem de neuropeptídeos na Doença de Parkinson

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

Pele da biópsia Explant Cultura para Derivação de primárias fibroblastos humanos

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

Isolamento de Oligómeros PrP solúveis e insolúveis no cérebro humano normal

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Transplante ortotópico de aorta em camundongos para o Estudo da Doença Vascular

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Modelos de interação gene-ambiente para desmasca mecanismos de suscetibilidade na doença de Parkinson

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Controlling Parkinson's Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time according to fluctuating disease and medication state. In the present realization of adaptive DBS we record and stimulate from the DBS electrodes implanted in the subthalamic nucleus of patients with Parkinson&#39;s disease in the early post-operative period. Local field potentials are analogue filtered between 3 and 47 Hz before being passed to a data acquisition unit where they are digitally filtered again around the patient specific beta peak, rectified and smoothed to give an online reading of the beta amplitude. A threshold for beta amplitude is set heuristically, which, if crossed, passes a trigger signal to the stimulator. The stimulator then ramps up stimulation to a pre-determined clinically effective voltage over 250 msec and continues to stimulate until the beta amplitude again falls down below threshold. Stimulation continues in this manner with brief episodes of ramped DBS during periods of heightened beta power.
Clinical efficacy is assessed after a minimum period of stabilization (5 min) through the unblinded and blinded video assessment of motor function using a selection of scores from the Unified Parkinson&#39;s Rating Scale (UPDRS). Recent work has demonstrated a reduction in power consumption with aDBS as well as an improvement in clinical scores compared to conventional DBS. Chronic aDBS could now be trialed in Parkinsonism.

Controlling Parkinson&#039;s Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) is effective for Parkinson&#8217;s disease, improving symptoms and reducing power consumption compared to conventional deep brain stimulation (cDBS). In aDBS we track a local field potential biomarker (beta oscillatory amplitude) in real time and use this to control the timing of stimulation.

Controlar a doença de Parkinson com Adaptive Estimulação Cerebral Profunda

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time ...

Developing Neuroimaging Phenotypes of the Default Mode Network in PTSD: Integrating the Resting State, Working Memory, and Structural Connectivity

Complementary structural and functional neuroimaging techniques used to examine the Default Mode Network (DMN) could potentially improve assessments of psychiatric illness severity and provide added validity to the clinical diagnostic process. Recent neuroimaging research suggests that DMN processes may be disrupted in a number of stress-related psychiatric illnesses, such as posttraumatic stress disorder (PTSD).
Although specific DMN functions remain under investigation, it is generally thought to be involved in introspection and self-processing. In healthy individuals it exhibits greatest activity during periods of rest, with less activity, observed as deactivation, during cognitive tasks, e.g., working memory. This network consists of the medial prefrontal cortex, posterior cingulate cortex/precuneus, lateral parietal cortices and medial temporal regions.
Multiple functional and structural imaging approaches have been developed to study the DMN. These have unprecedented potential to further the understanding of the function and dysfunction of this network. Functional approaches, such as the evaluation of resting state connectivity and task-induced deactivation, have excellent potential to identify targeted neurocognitive and neuroaffective (functional) diagnostic markers and may indicate illness severity and prognosis with increased accuracy or specificity. Structural approaches, such as evaluation of morphometry and connectivity, may provide unique markers of etiology and long-term outcomes. Combined, functional and structural methods provide strong multimodal, complementary and synergistic approaches to develop valid DMN-based imaging phenotypes in stress-related psychiatric conditions. This protocol aims to integrate these methods to investigate DMN structure and function in PTSD, relating findings to illness severity and relevant clinical factors.

This protocol describes the complementary neuroimaging techniques of resting state structural connectivity, task-induced deactivation, and structural connectivity analyses to examine the default network in post-traumatic stress disorder. The use of synergistic methods could potentially lead to improved diagnostics and assessments of severity, outcome, and other relevant clinical factors.

Desenvolver Neuroimagem fenótipos da rede de modo padrão no TEPT: Integrando o estado de repouso, Memória de Trabalho e Conectividade Estrutural

Complementary structural and functional neuroimaging techniques used to examine the Default Mode Network (DMN) could potentially improve assessments of ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Uso de ultra-alta MRI campo em pequeno roedor modelos de doença renal policística para<em&gt; In Vivo</em&gt; Fenotipagem and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...